Animale

Toți șoarecii erau masculi C57BL/6 în vârstă de 3-11 luni la momentul testării. Șoarecii au fost achiziționați de la laboratoarele Jackson, au fost adăpostiți într-o instalație cu temperatură (22 °C) și lumină controlată și au avut acces liber la hrană și apă. Șoarecii au fost eutanasiați prin supradozaj cu izofluran. Toate procedurile și utilizarea animalelor au fost aprobate de Comitetul de evaluare instituțională de la Universitatea East Carolina. Îngrijirea animalelor a respectat Ghidul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator, Institutul de Resurse pentru Animale de Laborator, Comisia pentru Științele Vieții, Consiliul Național de Cercetare (Washington: National Academy Press, 1996).

Disecția FDB

Critic pentru orice procedură care utilizează FDB este o disecție atentă care previne deteriorarea mușchiului (mușchiul este înconjurat de o zonă de țesut conjunctiv dens) (a se vedea Fig. 1). Pentru a facilita disecția, degetele de la picioare au fost fixate pe o tablă de plută, fixând piciorul în poziție cu talpa piciorului orientată în sus. Apoi, pielea de la capătul proximal al piciorului (deasupra calcaneului) a fost ciupită, permițând microfoarfecelor să facă incizii de-a lungul marginilor laterale ale piciorului până la degetele de la picioare. Tot prinzând pielea de deasupra calcaneului, microfoarfecele au fost folosite pentru a separa pielea de musculatura subiacentă. Lamboul de piele rămas a fost decojit și îndepărtat pentru a expune FDB și tendoanele degetelor de la picioare. Tendonul proximal a fost apoi tăiat și, în timp ce se ținea tendonul cu forcepsul, s-a tăiat FDB din fascia subiacentă. Tendonii degetelor de la picioare au fost apoi tăiați pentru a elibera FDB de picior.

Solizarea miofibrelor

După disecția FDB, mușchii au fost plasați în medii de cultură proaspete (DMEM cu glutamină, 2% FBS filtrat steril, 0.1% gentamicină) suplimentat cu 4 mg/ml colagenază A (Roche – 11088793001) timp de 90-120 min la 37 °C la 5% CO2, așa cum a fost descris anterior . Mușchiul FDB a fost plasat în 2 ml de mediu de cultură fără colagenază și a fost triturat ușor împotriva peretelui vasului pentru a elibera fibrele din fascicul cu ajutorul capătului tăiat al unui vârf de pipetă P1000. Miofibrele izolate au fost lipite de vase cu fund de sticlă care au fost acoperite cu entactină-colagen-laminină (ECL Cell attachment matrix, #08110 Millipore). Fibrele au fost readuse la 37 °C în 5% CO2 timp de câteva ore și ulterior au fost imaginate așa cum este descris mai jos.

Lungimea fibrelor musculare FDB

Mușchii FDB ai șoarecilor masculi și femele C57BL/6 au fost legați la tendonul proximal și la cele trei tendoane mediale ale degetelor de la picioare cu sutură de mătase și fixați de o clemă metalică pentru a menține tensiunea de repaus. Miofibrele au fost izolate așa cum s-a descris mai sus, dar nu au fost lipite de plăci cu fund de sticlă. Miofibrele au fost imaginate folosind un obiectiv ×4 și un microscop EVOS XL core și software-ul aferent (Life Technologies, Bothell, WA). Lungimile a aproximativ 1000 de miofibrile au fost măsurate în ImageJ (versiunea 1.6.0, NIH, Bethesda, MD). Atunci când au fost izolate, miofibrele nu mai erau în tensiune și, prin urmare, nu au reprezentat lungimea optimă. Pentru a ține cont de această modificare a lungimii miofibrelor, a fost utilizat un factor de conversie folosind lungimea sarcomerelor, așa cum a fost descris anterior de Dr. Richard Lieber . Atunci când se află la lungimea optimă, lungimea optimă presupusă a sarcomerei musculare de șoarece a unei miofibre este de 2,5 μm în diametru . Pentru a normaliza lungimile miofibrelor la lungimea sarcomerelor, am măsurat lungimea sarcomerelor într-un subset de 30 de miofibre. A fost măsurată distanța dintre 10 sarcomere din fiecare miofibră și a fost calculată o lungime medie a sarcomerelor în toate cele 30 de miofibre. Lungimea optimă a sarcomerului (2,5 μm) împărțită la lungimea medie măsurată a sarcomerului a produs un factor de conversie de 1,14, care a fost utilizat pentru a normaliza toate lungimile miofibrelor măsurate la lungimea optimă a sarcomerului.

Tipul de fibră individuală și dimensiunea fibrelor

Analiza tipului de fibră musculară a FDB a fost efectuată pe probe de la șoareci C57BL/6, așa cum a fost descrisă anterior . Secțiunile au fost probate cu anticorpi primari împotriva lanțului greu de miozină de tip I (BA-F8), IIa (SC-71), IIb (BF-F3) (Development Studies Hybridoma Bank, Univ of Iowa) și anti-distrofină (Rb-9024, Thermo Fisher, Waltham, MA), apoi au fost imaginate cu ajutorul unui microscop auto EVOS FL și a software-ului aferent (Life Technologies, Bothell, WA). Tipul de fibră și aria secțiunii transversale a fibrelor (CSA) au fost evaluate folosind ImageJ, așa cum a fost descris anterior .

Producția de forță izometrică

Producția de forță izometrică și oboseala a fost evaluată în mușchii EDL (n = 5), soleus (n = 4) și FDB (n = 6) ai șoarecilor C57BL/6, așa cum a fost descris anterior cu ușoare modificări. FDB a fost expus și tendonul proximal a fost fixat cu ajutorul suturii de mătase. Forceps cu vârf fin au fost plasate sub cele trei tendoane mediale ale degetelor de la picioare și trase ușor în jos spre degetele de la picioare înainte ca cele trei tendoane (Fig. 1) să fie fixate cu sutură de mătase. Am legat cele trei tendoane mediale deoarece nu este posibilă legarea unuia dintre degetele de la picioare din cauza locației anatomice, iar legarea celui de-al patrulea tendon nu are ca rezultat, din experiența noastră, o forță absolută diferită (datele nu sunt prezentate). Fiecare tendon a fost apoi tăiat chiar deasupra nodului, iar FDB a fost ușor ridicat de pe picior. Microfoarfecele au fost folosite pentru a îndepărta orice țesut conjunctiv rămas, eliberându-l de picior. Mușchiul a fost apoi legat la un transductor de forță și suspendat în soluție tampon Krebs Ringer oxigenată (KRB- 115 NaCl, 2,5 KCl, 1,8 CaCl2, 2,2 Na2HPO4, 0,85 NaH2PO4) la temperatura camerei. Lungimea mușchiului a fost apoi ajustată până când FDB a produs o forță de contracție maximă, moment în care a fost stabilită tensiunea optimă de repaus (Lo) și mușchiul a fost lăsat să se echilibreze timp de 10 minute. Mușchii soleus au fost pregătiți prin legarea unui nod pătrat dublu la tendonul soleus distal. Tendonul a fost tăiat deasupra nodului și mușchii posteriori au fost îndepărtați ușor de picior, dezvăluind tendonul proximal al mușchiului solear, care a fost legat cu un nod dublu pătrat. EDL a fost disecat și legat așa cum a fost descris anterior. Mușchii EDL și soleus au fost echilibrați în KRB oxigenat la temperatura camerei la tensiune de repaus timp de 10 minute. După echilibrare, tensiunea musculară a fost optimizată prin efectuarea de stimulări maxime de contracție și ajustarea lungimii mușchiului până la atingerea forței maxime. Stimulările de contracție au fost efectuate la un interval de 30 de secunde pentru a evita obosirea mușchiului. Mușchii au fost apoi stimulați la 60 s distanță la 10, 20, 40, 60, 80, 100 și 120 Hz pentru a genera o curbă de frecvență a forței. Mușchii au fost odihniți timp de încă 1 minut înainte de a finaliza un protocol de stimulare de 10 minute pentru a determina rezistența la oboseală. Protocolul de oboseală a stimulat mușchii la 30 Hz la fiecare 2 s pentru o perioadă de 600 s, pentru un total de 300 de contracții. Lungimea optimă a mușchilor a fost înregistrată, iar mușchii au fost tamponați pentru a elimina excesul de KRB înainte de a fi cântăriți. O tensiune optimă de 20 V a fost stabilită înainte de experimente pentru a asigura stimularea maximă a FDB, EDL și soleus (datele nu sunt prezentate). Datele privind forța musculară absolută au fost convertite în forță specifică (N/cm2) utilizând ecuațiile descrise anterior pentru estimarea matematică a CSA musculară și a zonei fiziologice a secțiunii transversale (PCSA) . Principala diferență între CSA și PCSA este includerea raportului dintre lungimea fibrelor musculare și lungimea mușchiului în ecuația PCSA. Am folosit ambele metode corectate pentru a oferi o compatibilitate mai largă cu literatura de specialitate.

Proprietăți contractile pasive

Proprietățile contractile pasive au fost evaluate în mușchii EDL și FDB de la șoareci masculi C57BL/6 (n = 4), așa cum a fost descris anterior , cu ușoare modificări. Mușchii EDL și FDB au fost disecați și legați la un traductor de forță, așa cum s-a descris mai sus. Mușchii au fost echilibrați timp de 10 min în KRB oxigenat la temperatura camerei. După echilibrare, tensiunea musculară a fost optimizată prin efectuarea de stimulări maxime de contracție și ajustarea lungimii mușchiului până când a fost obținută forța maximă. Stimulările de contracție au fost efectuate la un interval de 30 s pentru a evita obosirea mușchiului. Lungimea de referință a mușchiului a fost măsurată ca fiind Lo înainte de a fi supus unei întinderi pasive de 105, 110, 115, 120, 125 și 130% din Lo. Mușchii au fost tamponați pentru a elimina excesul de KRB și apoi cântăriți. Datele au fost corectate în funcție de CSA și PCSA.

Leziuni provocate de cardiotoxina (CTX)

S-au făcut comparații la șoareci C57BL/6 între o FDB tratată cu CTX (Naja nigricollis, #02152238, MP Biomedicals, Santa Ana, CA) și FDB contralaterală tratată cu PBS la 4 zile (n = 4) și la 10 zile după tratament (n = 2). Seringile 31G sterile de 8 mm lungime au fost pregătite cu 10 μL de 10 μM CTX sau 10 μL de 1× PBS steril, așa cum a fost descris anterior . După anestezia indusă cu izofluran, baza picioarelor a patru șoareci a fost curățată cu șervețele cu alcool. CTX a fost injectat în porțiunea proximală a piciorului, cu acul poziționat sub piele și spre degetele de la picioare. PBS a fost injectat în piciorul contralateral. Șoarecii au fost sacrificați la momentul potrivit, iar FDB-urile au fost disecate pentru măsurarea producției de forță, așa cum s-a descris mai sus. Datele au fost corectate în funcție de PCSA.

Colorarea cu hematoxilină și eozină

Mușchii FDB supuși la 10 zile de tratament cu CTX au fost congelați instantaneu în soluție de temperatură optimă de tăiere (OCT) pentru secționare și colorare H&E, așa cum a fost descris anterior .

Respirometrie mitocondrială de înaltă rezoluție a mușchilor scheletici

Prepararea fasciculelor de fibre musculare permeabilizate ale mușchilor gastrocnemius și FDB

Respirometria a fost efectuată pe fascicule musculare izolate permeabilizate ale mușchilor gastrocnemius și FDB extirpate din același membru al șoarecilor C57BL/6 (n = 4). O porțiune din gastrocnemius roșu a fost disecată și utilizată pentru prepararea fasciculelor de fibre permeabilizate, așa cum a fost descris anterior . Mușchiul gastrocnemius roșu a fost utilizat ca țesut comparativ, deoarece este utilizat în mod obișnuit pentru a evalua respirația mitocondrială a mușchiului scheletic murin . Protocolul pentru prepararea fasciculelor de fibre musculare FDB permeabilizate a fost adaptat din metodele descrise anterior privind permeabilizarea fasciculelor de mușchi gastrocnemius roșu și este prezentat mai jos. FDB au fost disecate și adăugate imediat în tamponul X rece ca gheața (-7,23 K2EGTA, 2,77 CaK2EGTA, 20 imidazol, 20 taurină, 5,7 ATP, 14,3 fosfocreatină, 6,56 MgCl2-6H2O, 50 MES, pH 7,1, 295 mosmol/kgH2O). Cu ajutorul unui microscop de disecție, țesutul conjunctiv, grăsimea și vasele de sânge au fost îndepărtate cu grijă pentru a evita pierderea mușchilor. FDB-urile au fost tăiate în mănunchiuri și împărțite în grupuri de trei până la patru mănunchiuri cu o greutate umedă de 1,5-2,0 mg. Grupurile de fascicule au fost apoi permeabilizate în tamponul X care conține 22,5 μg/ml saponină, cu rotație continuă la 4 °C timp de 5 minute. Fasciculele musculare au fost transferate imediat în tamponul Z rece ca gheața (-110 K-MES, 35 KCl, 1 EGTA, 5 K2HPO4, 3 MgCl2-6H2O, 5 mg/ml BSA, pH 7,4, 295 mosmol/kgH2O) și au fost spălate cu rotație continuă la 4 °C timp de 15 minute.

Respirația mitocondrială

Măsurătorile consumului de O2 de înaltă rezoluție au fost efectuate cu ajutorul OROBOROS Oxygraph-2K (Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria) la 37 °C cu o concentrație inițială de oxigen de ~ 300-350 μM, așa cum s-a descris anterior . Experimentele au fost efectuate în tamponul Z care conține 20 mM creatină monohidrat și 25 μM blebbistatină. Respirația mitocondrială a fost evaluată prin adăugarea secvențială de substraturi la o concentrație finală de piruvat 4 mM, malat 0,5 mM, glutamat 5 mM, ADP 2.5 mM, succinat 5 mM, citocrom c 5 μM, rotenonă 10 μM, antimicină A 5 μM, acid ascorbic 2 mM și TMPD 0,5 mM (dihidroclorură de N,N,N′,N′-tetrametil-p-fenilendiamină). Integritatea membranei mitocondriale a fost confirmată prin excluderea fasciculelor musculare gastrocnemius și a fasciculelor musculare FDB care au produs o creștere > 10 sau > 20 % a respirației, respectiv, după adăugarea de citocrom c exogen. Un criteriu de excludere diferit a fost utilizat pentru fasciculele musculare gastrocnemius și FDB, deoarece testele preliminare au indicat că o creștere procentuală mai mare a respirației a fost comună în fasciculele de fibre FDB în comparație cu fasciculele de fibre gastrocnemius, în urma adăugării de citocrom c. La finalizarea protocolului, fasciculele musculare au fost clătite în H2O distilată, liofilizate (Labconco, Kansas City, MO) și cântărite (Orion Cahn C-35, Thermo Electron, Beverly, MA). Ratele de respirație pentru fasciculele musculare gastrocnemius intacte sunt în mod obișnuit corectate în funcție de greutatea uscată; cu toate acestea, din cauza diferențelor în conținutul de țesut conjunctiv al celor două grupuri musculare, valorile JO2 au fost, de asemenea, corectate în funcție de proteinele totale și de activitatea citrat-sintetazei (CS). Activitatea CS a fost măsurată cu ajutorul kitului CS0720. Substanțele chimice și reactivii au fost achiziționați de la Sigma Aldrich.

Microscopie

In vitro

Fibrele musculare FDB au fost izolate de la șoareci C57BL/6 și atașate la vase cu fund de sticlă de 35 mm acoperite cu ECL, așa cum s-a discutat anterior. Miofibrele izolate au fost colorate cu mitotracker deep red (M2246, Thermo Fisher) și NucBlue (R37605, Thermo Fisher) în DMEM timp de 30 min. Fibrele au fost spălate de trei ori cu 2 ml de KRB. Fibrele au fost imaginate cu ajutorul unui microscop confocal cu scanare laser cu un singur foton, cu un obiectiv cu imersie în ulei ×60 (Olympus, Plan Apochromat, NA 1,35), iar excitația a fost realizată cu ajutorul liniilor de 405 și 488 nm ale unui laser cu argon multiliniar.

In vivo

Generarea celei de-a doua armonici descrie efectul optic produs de trecerea impulsurilor laser prin materiale foarte polarizate, necentric-simetrice, cum ar fi miozina. Atunci când sunt polarizate la lungimea de undă corespunzătoare, aceste materiale emit lumină la jumătatea lungimii de undă a celei care intră, producând imagini de înaltă rezoluție fără a fi nevoie de sonde fluorescente care sunt supuse la fotoblanșire și fototoxicitate. În plus, lungimile de undă în infraroșu apropiat utilizate permit penetrarea profundă a țesuturilor fără a fi nevoie de proceduri invazive . Șoarecii C57BL/6 au fost anesteziați înainte de a li se îndepărta pielea care acoperă FDB, expunând mușchiul FDB. Odată expus, FDB a fost hidratat cu KRB steril, iar șoarecele a fost așezat în decubit ventral pe un capac de sticlă (#1.5, Leica), așa cum a fost descris anterior (Fig. 1C). Moleculele care conțin miozină și nicotinamidă au fost excitate la 900 și 720 nm cu ajutorul unui laser pulsat Ti:Sapphire cu modul blocat (seria Mai Tai Deep See HP, Spectra-Physics, Santa Clasa, CA), iar emisia a fost înregistrată cu ajutorul detecției fără scanare cu un filtru FV10 MRV/G setat la 450 și, respectiv, 420 nm. Toate imaginile au fost realizate cu ajutorul unui obiectiv cu imersie în ulei ×60 (Plan Apochromat, NA 1,35) și a unui Olympus FV1000 LSM care operează software-ul de achiziție FV10-ASW 4.2.

Electroporarea ADNc și respirometria de înaltă rezoluție a mușchiului scheletic care supraexprimă Pgc1α

Electroporarea ADNc în FDB a fost efectuată așa cum a fost descrisă anterior. Pe scurt, picioarele a șapte șoareci C57BL/6 masculi și femele C57BL/6 anesteziați au fost curățate cu un șervețel cu alcool, iar labele picioarelor au fost injectate cu 10 μl de 2 mg/mL de hialuronidază suspendată în KRB filtrată steril cu ajutorul unui ac steril de calibru 31 cu o lungime de 8 mm. Aproximativ 1 h, mai târziu, șoarecii au fost anesteziați pentru a doua oară. Picioarele au fost din nou curățate cu un șervețel cu alcool și un picior a primit 30 μg de plasmidă PGC1α marcată cu proteină fluorescentă verde (GFP), iar piciorul contralateral a fost injectat cu ADNc YFP. După o recuperare completă din anestezie, șoarecii au fost anesteziați pentru a treia oară ~ 10 min mai târziu. Electrozii de platină au fost introduși sub piele și poziționați perpendicular pe FDB și paralel unul cu celălalt la nivelul călcâiului și al tălpii sub degetele de la picioare. FDB a fost stimulată cu 20 de impulsuri cu durata de 20 ms la 1 Hz și 100 V . Șoarecii au fost sacrificați 14 zile mai târziu, iar FDB-urile au fost disecate și imaginate la un microscop fluorescent pentru a confirma expresia plasmidică. Probele de mușchi FDB intacte au fost apoi pregătite și măsurate pentru respirația mitocondrială, așa cum a fost schițat mai sus.

Statistică

Distribuția datelor a fost evaluată, iar datele care nu s-au conformat unei distribuții normale au fost transformate în baza 10 logaritmică. Datele privind frecvența forței contractile au fost analizate prin ANOVA cu două căi cu comparații multiple Tukey. Masa musculară, tipul de fibre, timpul până la maxim și până la jumătatea relaxării și datele privind oboseala au fost analizate prin ANOVA cu o singură cale cu comparații multiple Tukey. În cazurile în care datele nu au putut fi transformate într-o distribuție normală, s-a efectuat un test Kruskal-Wallis cu comparații multiple Dunn. ANOVA-urile au fost finalizate cu ajutorul GraphPad Prism 7.03. Datele respiratorii și activitatea CS au fost analizate prin intermediul testelor t cu două cozi perechi cu un nivel alfa de 0,05 utilizând Microsoft Excel. Toate datele sunt prezentate ca medie ± SEM.

.