Avântul medicinei „de precizie” este caracterizat de multe îmbunătățiri noi în metodele și regimurile de diagnostic, prognostic și tratament. Ca parte a acestei inițiative, s-a pus accentul pe reducerea la minimum a cantității de țesut necesar pentru testare prin proceduri mai puțin invazive și mai sigure. O metodă care a stârnit un interes considerabil în ultimii ani este „biopsia lichidă”. În timp ce definițiile variază în ceea ce privește sensul exact al acestui termen, acesta poate fi considerat, în linii mari, ca fiind colectarea unei probe de lichid corporal pentru a testa biomarkerii relevanți pentru a informa managementul pacientului. Cel mai frecvent se aplică recoltării de sânge periferic pentru analiza acizilor dezoxiribonucleici (ADN) tumorali circulanți liberi de celule.
Prima descriere a ADN-ului circulant liber de celule în sângele uman a avut loc în 1948, dar acest lucru a captat puțină atenție în comunitatea științifică mai largă 2. În 1977, oamenii de știință au identificat prezența unor niveluri anormal de ridicate de ADN liber de celule (cfADN) în plasma și serul pacienților cu cancer în raport cu pacienții de control al stării de sănătate și s-a presupus că acest cfADN reprezintă în principal ADN tumoral circulant (ADNcTc)1,5. De la această descriere inițială, alte cercetări au constatat că un nivel crescut de cfDNA reflectă, în general, o multitudine de procese patologice, inclusiv afecțiuni neoplazice maligne și benigne, boli inflamatorii, accidente vasculare cerebrale, traumatisme și sepsis. În timpul acestor procese, acizii nucleici pot fi eliminați în sânge de către celulele apoptotice și necrotice sau prin secreție controlată de către celulele vii2,11. În timp ce ADN-ul liber de celule este adesea folosit ca sinonim cu ADN-ul tumoral circulant, trebuie reamintit faptul că ADN-ul circulant non-tumoral și non-uman poate fi, de asemenea, prezent într-o probă.
În timp ce accentul actual este dominat de ADN, componentele suplimentare ale unei biopsii lichide includ acizii ribonucleici (ARN), celulele tumorale circulante (CTC), veziculele extracelulare (EV) și trombocitele educate de tumori (TEP). Aceste din urmă componente prezintă în principal interes pentru cercetare. Pe măsură ce se efectuează mai multe cercetări translaționale, aceste componente suplimentare ale unei biopsii lichide ar putea avea o utilizare clinică în creștere în viitor. O trecere în revistă a acestor elemente depășește scopul acestui articol, iar cititorul este trimis la articolul lui Batth et al. pentru o lectură suplimentară.
Considerații tehnologice
Până de curând, tehnologia disponibilă nu a fost suficient de sensibilă pentru a detecta ADNc și a o utiliza în mod semnificativ. Spre deosebire de testele moleculare efectuate pe fluidele corporale pentru detectarea acizilor nucleici proveniți de la viruși și alte microorganisme, care beneficiază de cantități relativ mari de acizi nucleici, fragmentele de acid nucleic tumoral circulant sunt prezente la o fracțiune din ADNct normal non-tumoral. ADNct sunt, de obicei, fragmente mici de ADN în intervalul de 140-170 perechi de baze (pb)3, iar tipul de tumoare, progresia, încărcătura, ratele de proliferare și terapia afectează cantitatea de ADNct dintr-o probă. În plus, deși ADNc este relativ stabil în plasmă și în ser, acesta este eliminat din circulație de către ficat și rinichi în câteva ore 3,4. Cu toate acestea, progresele înregistrate în procesele preanalitice și în metodele de purificare au permis captarea, amplificarea și secvențierea cu succes a ADNcT.
Metodele care sunt utilizate în prezent pentru a detecta sau măsura ADNcT pot fi împărțite, în linii mari, în două categorii: bazate pe reacția în lanț a polimerazei (PCR) și bazate pe secvențierea de generație următoare (NGS). Testele bazate pe PCR au, în general, un timp de execuție mai rapid și sunt mai puțin costisitoare, dar, de obicei, pot evalua doar una sau câteva mutații specifice la un moment dat (capacitate limitată de multiplexare). Abordările bazate pe PCR pot fi subdivizate în continuare în metode care îmbogățesc secvențele mutante în raport cu cele de tip sălbatic (non-mutante) și cele care realizează cuantificarea prin compartimentare. Un exemplu al celui din urmă grup este „PCR digital”, care devine utilizat pe scară largă pentru detectarea și cuantificarea mutațiilor specifice, cunoscute, în ADNcT. PCR este compartimentată în mii de volume de reacție individuale minuscule, fie pe un cip, fie prin crearea de picături de apă în ulei. Fiecare compartiment sau picătură conține sau nu un fragment de șablon vizat și produce un semnal fluorescent dacă un fragment de șablon adecvat este prezent în acel volum. Prin numărarea volumelor fluorescente individuale, este posibil să se estimeze numărul de molecule de șablon cu țintă specifică din eșantion. Pentru mai multe ținte testate simultan (multiplexare), diferite semnale fluorescente pot fi atribuite unor secvențe de variante specifice.
Abordările bazate pe secvențiere de generație următoare permit evaluarea unei game mult mai largi de mutații posibile, deoarece secvențierea poate detecta mutațiile care apar oriunde în cadrul regiunilor capturate. Pentru a viza regiunile genomului predispuse la mutații, bibliotecile NGS pot fi pregătite din ADN-ul plasmatic utilizând fie metode de captare prin ligare/hibridare, fie metode de îmbogățire prin PCR țintit. Fracțiile de alele variante sunt, în general, mult mai mici în biopsiile lichide decât în biopsiile tisulare, adesea <1%, astfel încât regiunile de interes trebuie secvențiate mai profund decât în NGS din țesutul tumoral primar. În plus, trebuie să se realizeze o optimizare extinsă a proceselor preanalitice și analitice pentru a maximiza eșantionul de intrare și a reduce erorile de PCR și de secvențiere. Abordările NGS au avantajul important de a putea obține o acoperire mult mai largă a mutațiilor (analiza simultană a mii de mutații posibile). Astfel, nu este necesară cunoașterea prealabilă a mutațiilor specifice ale tumorii. Cu toate acestea, în comparație cu metodele mai simple bazate pe PCR, tehnicile NGS sunt mai costisitoare, consumatoare de timp și mai dificile din punct de vedere tehnic.
Avantaje și dezavantaje
Avantajele biopsiilor lichide constau predominant în natura mult mai puțin invazivă a procedurilor de obținere a acestora în raport cu biopsiile tumorale standard. Luați în considerare, de exemplu, procesul implicat pentru a face biopsia unei mase pulmonare. În cazul în care masa se află într-o locație care este accesibilă prin radiologie intervențională sau biopsie chirurgicală, există riscul de pneumotorax sau hemoragie, în pofida costului de menținere a unei suite operatorii în cadrul căreia să se efectueze operația. Biopsiile lichide permit, de asemenea, prelevări mai frecvente și în serie de-a lungul timpului pentru a oferi o rezoluție mai bună a comportamentului tumorilor, precum și a răspunsului acestora la terapie. De exemplu, într-un studiu, pacienții cu cancer colorectal care au demonstrat ulterior, din punct de vedere radiografic, un răspuns bun la tratament, au avut o scădere de >90% a nivelurilor de ctDNA după primele 2 săptămâni de tratament 9. S-a demonstrat că acest lucru permite stratificarea riscului de recidivă după rezecția cu intenție curativă. Într-un alt studiu, pacientele cu cancer de sân cu ADNc detectabil după rezecție au avut un risc de 25 de ori mai mare de recidivă 10. Aceste concepte sunt analoage cu testele care se efectuează în prezent pentru tumorile maligne hematologice, cum ar fi leucemia mielogenă cronică (LMC) și testarea în serie a prezenței transcriptelor de fuziune BCR-ABL. În cele din urmă, în cazurile în care nu este disponibilă o biopsie tisulară, profilarea moleculară a tumorilor poate fi în continuare realizată prin biopsie lichidă.
Dezavantajele importante ale biopsiei lichide includ necesitatea obținerii unui diagnostic histologic inițial prin biopsie tisulară. Laboratoarele care efectuează aceste analize trebuie să fie atente la utilizarea adecvată a testelor și la potențialul de „suprainterpretare” în context clinic. Frecvența scăzută a variantelor din cadrul sângelui periferic poate duce la rate mai mari de fals negative și necesită eforturi tehnice și expertiză semnificativ mai mari pentru a obține rezultate fiabile.
Aplicații actuale și emergente
Utilizarea clinică a biopsiei lichide a crescut semnificativ din 2014, când a devenit disponibilă prima platformă de biopsie lichidă multigene disponibilă în comerț. Mai multe teste sunt disponibile în comerț și aprobate de FDA, iar unele sunt considerate suficiente pentru eligibilitatea tratamentului de către companiile de asigurări. De exemplu, în 2016, FDA a aprobat testul cobas® EGFR Mutation Test v2 pentru a determina eligibilitatea pacienților cu cancer pulmonar cu celule non-mici pentru a primi anumiți inhibitori de tirosin-kinază EGFR . Adoptarea biopsiei lichide pentru a exclude pacienții de la terapia țintită a cunoscut o adoptare clinică mult mai lentă, în principal din cauza preocupărilor legate de falsurile negative și de țesutul tumoral în general accesibil 3. Utilizarea clinică în creștere a fost, de asemenea, determinată de pacienții și medicii care doresc să identifice mutațiile care pot fi țintite pentru utilizare off-label sau pentru înscrierea în studii clinice.
Utilizările emergente ale biopsiilor lichide includ utilizarea acestora ca o completare a profilului mutațional al biopsiei tisulare, evaluarea răspunsului la tratament, monitorizarea bolii reziduale, detectarea recidivei bolii și monitorizarea apariției mutațiilor de rezistență 3.
Direcții viitoare
Specificitatea anticipată a mutațiilor specifice cancerului face ca ADNc să fie un biomarker atractiv pentru detectarea precoce a cancerului, ceea ce ar putea avea un impact enorm asupra îngrijirii pacienților. Cu toate acestea, deoarece se știe că tumorile în stadiu incipient eliberează foarte puțin ADN, există multe provocări tehnice care trebuie depășite. Deși biopsia lichidă poate fi un instrument atractiv pentru depistarea cancerului la pacienții asimptomatici, astfel de aplicații vor trebui să fie analizate cu atenție și chibzuință pentru a evita suferința și costurile excesive ale pacienților din cauza rezultatelor fals pozitive. Pe termen scurt, biopsiile lichide pot fi mai utile pentru a confirma malignitatea la pacienții cu leziuni deja evidente clinic sau radiografic.
Concluzie
Literatura axată pe testarea ADNc se extinde și evoluează rapid. Domeniile de investigație în curs de desfășurare includ procesele preanalitice, factorii care afectează rata de detecție a ADNcT și studiile clinice prospective. Este probabil să asistăm la un rol mai răspândit al ctDNA în îngrijirea clinică, deoarece cercetările continue privind CTC-urile, cfDNA/ARN și veziculele extracelulare vor oferi o rezoluție sporită la instantaneul statutului tumoral obținut prin biopsii lichide 4.
.