15 lutego 2010 (Vol. 30, No. 4)

Scott B. Mohler

Simple Steps for Successful Bioluminescence Animal Imaging

Lucyferyna jest podstawowym substratem w badaniach bioluminescencyjnych. Oparta na prostej reakcji, w której ATP napędza lucyferazę katalizującą lucyferynę w celu wytworzenia światła, bioluminescencja ma szerokie zastosowanie. Jej wykorzystanie jako wskaźnika biomasy pozwala na wykrywanie mikroorganizmów w produktach konsumenckich, powierzchniach zakładów produkcyjnych, a nawet została wykorzystana do określenia, czy życie istnieje na Księżycu i Marsie.

Bioluminescencja jest wykorzystywana w monitorowaniu in vitro i in vivo procesów biologicznych, w tym ekspresji genów i interakcji białko-białko. Lucyferyna jest stosowana, na przykład, w badaniach genów reporterowych do badania regulacji i funkcji genów, gdzie ekspresja reportera znakowanego lucyferyną jest markerem wskazującym na udane pobranie interesującego nas genu w technikach rekombinacji DNA. Jako odczynnik wykrywający, reakcja lucyferyna-lucyferaza jest wykorzystywana w pirosekwencjonowaniu do szybkiego wykrywania zasad w dzisiejszych systemach sekwencjonowania DNA o wysokiej przepustowości.

Ostatnio, obrazowanie bioluminescencyjne pojawiło się jako potężna technika do bezpośredniego badania różnych populacji komórek u żywych małych zwierząt, takich jak myszy. W tej technice, komórki (np. komórki nowotworowe, komórki macierzyste, limfocyty T) są zaprojektowane tak, aby wyrażały lucyferazę i świeciły. Nieinwazyjna wizualizacja u żywych zwierząt przy użyciu czułej kamery ładunkowo-sprzężonej umożliwia obserwację w czasie rzeczywistym progresji i regresji choroby w różnych momentach w trakcie leczenia terapeutycznego. Stosowana w celu zrozumienia molekularnych podstaw patologii takich jak zaburzenia neurodegeneracyjne, zaburzenia sercowo-naczyniowe, otyłość i nowotwory, technika ta ma ogromną wartość dla badań klinicznych, diagnostycznych i rozwoju leków.

Naukowcy z Regis Technologies zidentyfikowali typowe słabe punkty testów lucyferazowych. Problemy często pojawiają się jeszcze przed rozpoczęciem badania. Lucyferyna Firefly’a jest wrażliwą cząsteczką i nawet dobrze zaplanowane eksperymenty mogą dać błędne wyniki, jeśli lucyferyna jest niewłaściwie traktowana i uszkodzona przed użyciem. W tym artykule opisujemy optymalną sól, czystość, obchodzenie się i przechowywanie lucyferyny, aby zapewnić udane i spójne wyniki w obrazowaniu zwierząt i innych badaniach.

Rozważania dotyczące zakupu

Badacze często zastanawiają się, której formy lucyferyny użyć. Sole potasowe i sodowe lucyferyny są zwykle używane zamiennie. Jednakże, rozpuszczalność cząsteczki jest ważnym czynnikiem, który należy rozważyć w przypadku niektórych badań. Sól sodowa jest bardziej rozpuszczalna w wodzie (>100 mg/mL) niż sól potasowa (55 mg/mL). Forma wolna od kwasu, choć nadal dostępna, nie jest często używana z powodu trudności w rozpuszczaniu.

Ponieważ kilka zanieczyszczeń może wpływać na eksperymenty w różny sposób, początkowa czystość odczynnika może być ważnym czynnikiem.

L-lucyferyna, enancjomer D-lucyferyny (Rysunek 1), jest znanym zanieczyszczeniem w syntetycznej lucyferynie. Chociaż wykazano, że funkcjonuje w reakcjach lucyferazowych, może wystąpić znaczne przesunięcie w szczytowej emisji światła w zależności od zastosowanych parametrów zbierania danych. L-lucyferyna jest łatwo wykrywana i oznaczana ilościowo przez chiralną HPLC i powinna być podana w certyfikacie analizy producenta. Większość lucyferyny powinna zawierać mniej niż 0,5% L-lucyferyny, chociaż wyższe limity mogą być prawdopodobnie tolerowane tak długo, jak poziomy L-lucyferyny pozostają stałe podczas całego eksperymentu.

Dehydrolucyferyna (Rysunek 1) jest zanieczyszczeniem, które działa jako inhibitor lucyferazy, tłumiąc wysokość błysku i całkowite scalenie. Próbka z domieszką 1% dehydrolucyferyny wykazuje mniej niż połowę wysokości błysku i mniej niż 25% całkowitej integracji w ciągu 15 minut. Dehydrolucyferyna może tworzyć się podczas syntezy lub przechowywania lucyferyny. Wybór producenta, który dostarcza niski poziom dehydrolucyferyny pomoże zapewnić wiarygodne i powtarzalne wyniki.

Wiele powszechnie występujących zanieczyszczeń śladowych z syntezy lucyferyny może hamować inne enzymy w złożonych systemach i może powodować zmienność eksperymentalną z powodu różnic między partiami lub między producentami.

Rysunek 1. Strukturalne porównanie D-lucyferyny i zanieczyszczeń

Magazynowanie

Lucyferyna jest wrażliwa na światło, tlen i wilgoć i musi być chroniona. Światło i tlen mogą katalizować utlenianie lucyferyny do dehydrolucyferyny. Pozostawiona w bursztynowej butelce pod azotem w temperaturze pokojowej, lucyferyna zacznie się rozkładać do dehydrolucyferyny po miesiącu (Rysunek 2), ale jest stabilna w nieotwartej butelce przez co najmniej dwa lata w zamrażarce. Rozpuszczona w wodzie z wystarczającą ilością tlenu lucyferyna przekształci się w dehydrolucyferynę w ciągu zaledwie kilku dni.

Lucyferyna powinna być kupowana i przechowywana w najmniejszej możliwej ilości, aby zapobiec rozkładowi do dehydrolucyferyny z wielokrotnych cykli zamrażania-rozmrażania-otwierania. W przypadku zakupu lucyferyny lucyferyny lucyferyny lucyferyny lucyferyny lucyferyny lucyferyny lucyferyny lucyferyny lucyferyny lucyferyny lucyferyny lucyferyny lucyferyny lucyferyny lucyferyny Długotrwałe przechowywanie w postaci zamrożonego roztworu nie jest zalecane w przypadku delikatnych zastosowań, takich jak badania na całych zwierzętach. Aby spowolnić rozkład w zamrożonych roztworach, przed zamrożeniem należy spasteryzować roztwór azotem lub argonem.

Rysunek 2. Rozkład lucyferyny do dehydrolucyferyny w zależności od czasu w temperaturze 25ºC i -20ºC

Postępowanie

Po otwarciu butelki z lucyferyną należy pozwolić jej dojść w pełni do temperatury pokojowej, a następnie przed ponownym zamknięciem oczyścić azotem lub argonem. Jeżeli roztwory lucyferyny mają być użyte w ciągu kilku godzin, nie są potrzebne żadne środki ostrożności. Roztwory, które będą używane przez jeden dzień, powinny być przepłukane azotem lub argonem. Roztwory nie powinny być używane przez kilka dni, ponieważ nastąpi tworzenie się dehydrolucyferyny.

Scott B. Mohler ([email protected]) jest menedżerem produktu w firmie Regis Technologies. Witryna internetowa: www.registech.com.