4.1. Mikrotubule

Znaczenie MTs dla demontażu FA zostało wykazane przy użyciu nocodazolu, który przerywa polimeryzację MTs w komórkach przylegających do ECM . Ekspozycja komórek na nocodazol stabilizuje struktury FA poprzez zapobieganie ich dezasemblacji, a tym samym zwiększa adhezję komórek do ECM. Usunięcie leku z podłoża hodowlanego inicjuje synchroniczny demontaż FA i odbudowę struktur MT. Tak więc zastosowanie tego leku pozwala na analizę procesu demontażu FA niezależnie od procesu formowania FA. Fosforylacja tyrozynowa białek w FAs wzrasta po ekspozycji na nokodazol i gwałtownie spada po jego usunięciu. Rozszerzenie MTs do FAs zostało zaobserwowane w mikroskopii przyżyciowej, a skierowanie MTs do FAs wydaje się wywoływać demontaż FA. Ponieważ białko motoryczne MT, kinezyna-1, zostało zaangażowane w regulację indukowanego przez MT demontażu FA, MT mogą dostarczać czynniki demontażu do FAs w sposób zależny od kinezyny-1.

Ponieważ rozszerzenie MTs do FAs wyzwala uwolnienie adhezji komórek i promuje migrację komórek, interesujące jest, w jaki sposób ukierunkowanie MTs do FAs jest regulowane podczas indukcji ruchliwości komórek. Rzeczywiście, GTPazy z rodziny Rho regulują wychwytywanie i stabilizację rozszerzonych MTs do kory komórkowej poprzez ich efektory downstream, a MTs z kolei wpływają na aktywność GTPaz Rho. Chociaż nie jest dokładnie jasne, w jaki sposób MTs kierują FAs, filamenty aktynowe przypuszczalnie odgrywają rolę.

4.2. Kinezyna-1

Kinezyna-1 jest członkiem nadrodziny białek motorycznych kinezyny i jest również znana jako konwencjonalna kinezyna . Kinezyna-1 odgrywa kluczową rolę w przemieszczaniu białek wzdłuż spolimeryzowanych MT w kierunku końca plusowego tych ostatnich. Hamowanie kinezyny-1 w fibroblastach Xenopus, przy użyciu specyficznego przeciwciała lub wymuszonej ekspresji dominuj±co-ujemnego mutanta, prowadzi do stabilizacji FAs z towarzysz±cym wzrostem ich rozmiarów i redukcj± ich liczby, co zaobserwowano w komórkach wystawionych na działanie nocodazolu. Wyniki te sugeruj±, że aktywno¶ć kinezyny-1 jest niezbędna do obrotu FA. Chociaż nocodazol hamuje polimeryzację MTs, hamowanie aktywności kinezyny-1 nie wpływa ani na kierowanie MTs do FAs, ani na dynamikę polimeryzacji MTs. Sugeruje to, że czynniki demontażu FA są przenoszone wzdłuż MTs w sposób zależny od kinezyny-1.

4.3. Focal Adhesion Kinase

FAK jest zaangażowana zarówno w dojrzewanie, jak i obrót FA. Jednakże niedobór FAK ma większy wpływ na demontaż niż na tworzenie FAs, powodując zmniejszenie szybkości obrotu FAs, co prowadzi do wzrostu poziomu FAs w stanie stacjonarnym. FAK zawiera N-końcową domenę FERM (białko 4.1, homologia ezryny, radiksyn i moesyn), centralną domenę kinazową oraz COOH-końcową domenę ukierunkowaną na adhezję ogniskową (FAT), jak pokazano na rycinie 4. Domena FERM występuje w wielu białkach i pośredniczy w interakcjach białko-białko. Wykazano, że domena FERM FAK wiąże się z CP integryny β1 i receptorami czynników wzrostu. Ostatnia analiza struktury domeny FERM wykazała, że wiąże się ona z katalityczną szczeliną domeny kinazowej. Ta wewnątrzcząsteczkowa interakcja zapobiega autofosforylacji Tyr397, która jest warunkiem koniecznym do sukcesywnej fosforylacji FAK przez Src. Autofosforylacja FAK przy Tyr397 jest podwyższona w wysoce ruchliwych i inwazyjnych komórkach nowotworowych. Src wiąże się z fosforylowanym Tyr397 i dalej fosforyluje wiele reszt tyrozynowych w obrębie FAK, w tym Tyr576 i Tyr577 w obrębie domeny kinazowej, Tyr861 zlokalizowany pomiędzy domeną kinazową i FAT oraz Tyr925 w obrębie domeny FAT. Fosforylacja w obrębie domeny kinazowej jest kluczowa dla pełnej aktywności kinazy. Fosforylowany Tyr861 pośredniczy w interakcji FAK z taliną i paksyliną. Fosforylacja przy Tyr925 jest niezbędna do interakcji FAK z Grb2. Wiązanie Grb2 z FAK pomaga rekrutować dynaminę do FAs. Ten trójskładnikowy kompleks jest odpowiedzialny za internalizację integryn i w ten sposób indukuje obrót FAs. Jednak rola FAK podczas demontażu FA nie jest tak prosta. Podczas gdy pTyr397 FAK jest wymagany do rekrutacji dynamin, jego deposforylacja jest indukowana po rozciągnięciu MTs do FAs, a to jest warunkiem wstępnym dla sukcesywnego demontażu FAs. FAK jest więc centralnym regulatorem formowania i demontażu FAs oraz przekazywania sygnałów pośredniczących w przekazywaniu integryn. Niemniej jednak, niedobór FAK ma niewielki wpływ na formowanie się FA, niemniej jednak wykazano, że stabilizuje on FA. Role FAK podczas tworzenia FA mogą być wykonywane przez inne redundantne kinazy lub czynniki rekrutowane do FAs.

4.4. Dynamina

Dynamina jest GTPazą, która została zidentyfikowana jako białko wiążące MT . Zidentyfikowano trzy niezależne geny dynaminy. Dynamina I ulega ekspresji specyficznie w neuronach, a Dynamina III wyłącznie w jądrze, płucach i mózgu, podczas gdy Dynamina II ulega ekspresji wszechobecnie. Struktura domeny wspólnej dla dynamin jest przedstawiona na Rysunku 4. Dynamina jest wymagana do internalizacji integryn podczas MT-zależnego obrotu FA. Terminus karboksylowy dynaminy zawiera motyw bogaty w prolinę (PR), który jest niezbędny do utworzenia trójskładnikowego kompleksu z FAK i Grb2. Motyw PR dynaminy oddziałuje również z MTs. Dynaminy rekrutowane do wewnętrznej powierzchni błony komórkowej łączą się w pierścień wokół FAs i inicjują internalizację integryn, gdy FAs są wystarczająco zdemontowane. Niedobór FAK wyraźnie zmniejsza akumulację dynamin wokół FAs. Interakcja polimeru tubuliny z dynaminą znacznie zwiększa aktywność GTPazową tej ostatniej, chociaż fizjologiczne znaczenie tego jest niejasne .

4.5. Fosfatazy

Szczególny zestaw białkowych fosfataz tyrozynowych pośredniczy w dephosforylacji FAK przy Tyr397 po przedłużeniu MTs do FAs . Należą do nich PTP-PEST, SHP-2 i PTP-1B. Nie jest jednak jasne, czy demontaż FA wymaga zgodnego działania wszystkich trzech fosfataz, czy też wystarczy działanie pojedynczej fosfatazy, w zależności od kontekstu komórkowego.

PTP-PEST jest znany z regulacji adhezji i migracji komórek (Figura 4) . Jak donoszą Zheng i wsp. PTP-PEST dephosphoryluje FAK na Tyr397 po aktywacji przez onkogenny sygnał indukowany Ras. Ras indukuje aktywację ERK poprzez kaskadę Fgd1-Cdc42-PAK1-MEK1, co ostatecznie prowadzi do interakcji pomiędzy FAK i PTP-PEST. Aktywowana ERK fosforyluje FAK przy Ser910, a fosforylowana Ser910 i przylegająca do niej reszta Pro911 służą jako miejsce wiązania dla izomerazy peptydylowo-prolylowej cis/trans (PIN1). PIN1 stymuluje wiązanie FAK do PTP-PEST, w sposób zależny od aktywności izomerazy PIN1, chociaż dokładna rola aktywności izomerazy nie jest jasna. PTP-PEST następnie dephosphoryluje pTyr397 . Intrygująco, zastąpienie FAK Tyr397 przez Phe promuje metastazę fibroblastów szczurów transformowanych v-H-Ras.

SHP-2 może również dephosphorylować FAK przy Tyr397 . SHP-2 zawiera dwie domeny SH2 na swoim N-końcu (Rysunek 4), a N-końcowa większość z nich działa jako wewnątrzcząsteczkowy inhibitor aktywności fosfatazy. Ta inhibicja może być zwolniona przez Gab2, białko dokowania zawierające domenę homologii pleckstrin (PH). Gab2 wiąże się z N-końcową domeną SH2 i odsłania domenę fosfatazy SHP-2, uwalniając wewnątrzcząsteczkową inhibicję. Niedobór SHP-2 w hodowanych komórkach zwiększa liczbę FAs i upośledza migrację komórek. Odkrycia te przypominają fenotyp komórek pozbawionych FAK. Jednakże nie ma jasnych dowodów na to, że SHP-2 lokalizuje się w FAs podczas ich obrotu. SHP-2 może być rekrutowany do FAs poprzez interakcję z fosforylowanymi tyrozynami Gab2 za pośrednictwem swoich dwóch domen SH2.

Istnieje kilka substratów dla PTP-1B w FAs, w tym FAK, Src i α-aktynina . PTP-1B jest skomplikowanym regulatorem FAK. Bezpośrednio pośredniczy w dephosforylacji pTyr397, ale może również promować fosforylację tej samej reszty tyrozynowej przez Src. Jak donosi Zhang, α-aktynina odgrywa kluczową rolę w podwójnej funkcji PTP-1B. α-aktynina ufosforylowana przy Tyr12 promuje dysocjację Src związanego z FAK przy pTyr397. Pozwala to PTP-1B na dephosforylację odsłoniętego pTyr397. Z drugiej strony, PTP-1B może zdeposforylować pTyr12 α-aktyniny tak, aby zwiększyć pulę Src wolną od α-aktyniny, która jest następnie dostępna do fosforylacji FAK. Jednocześnie PTP-1B może aktywować Src poprzez dephosphorylację Src pTyr527, co pośredniczy w wewnątrzcząsteczkowym hamowaniu aktywności Src. Ogólnie rzecz biorąc, dephosforylacja FAK przez PTP-1B zwiększa następczą fosforylację FAK przez Src. Te funkcje PTP-1B mogą odgrywać rolę w dynamicznym obrocie FAs podczas dynamicznego przyłączania komórek, a nie tylko poprzez promowanie odłączania.

4.6. m-Kalpaina

m-Kalpaina, znana również jako Calpain-2, jest członkiem rodziny kalpain proteaz zależnych od wapnia wewnątrzkomórkowego. Składa się ona z pięciu funkcjonalnie i strukturalnie odrębnych domen. Domena I to możliwy region autoinhibicyjny, który ulega rozszczepieniu w procesie autolizy. Domena II jest domeną katalityczną składającą się z dwóch rozszczepionych subdomen (IIa i IIb) połączonych pętlą zwaną szczeliną katalityczną (catalytic cleft). Domena III jest przypuszczalnym regionem regulacyjnym aktywności proteazy i zawiera miejsca wiążące fosfolipidy. Domena IV zawiera cztery motywy EF-hand, które są niezbędne do wiązania wapnia.

Wykazano, że m-kalpaina reguluje obrót FAs poprzez rozszczepianie wielu białek związanych z FA, takich jak talina, FAK i paksylina. Talin jest dobrze poznanym substratem m-kalpainy podczas obrotu FA. m-kalpaina rozszczepia miejsce pomiędzy domenami głowy i pręcika i w ten sposób wywołuje strukturalny rozpad szkieletu FA. FAK jest również rozszczepiany przez m-kalpainę pomiędzy dwiema C-końcowymi domenami PR. Rozbicie FA przez m-kalpainę wymaga również MTs. Mimo że dokładna rola MTs w rozkładzie FA przez m-kalpainę jest niejasna, ZF21 prawdopodobnie odgrywa pewną rolę, jak wyjaśniono w następnym rozdziale. FAK może wiązać zarówno ERK/MAPK, jak i m-kalpainę, i może być platformą, na której m-kalpaina może być aktywowana przez ERK/MAPK. Rozszczepienie składników FAs przez m-Calpainę przypuszczalnie ułatwia internalizację integryn poprzez zaburzenie wzajemnie połączonej dużej struktury FAs.

4.7. ZF21

ZF21 zawiera domenę FYVE, która wiąże się z fosfatydyloinozytolo-3-fosforanem, który jest wzbogacony w warstwy lipidowe błon plazmatycznych. Chociaż istnieje 38 białek zawierających domenę FYVE u ssaków, niekoniecznie mają one wspólne struktury domenowe lub funkcje. ZF21 początkowo przyciągnął naszą uwagę jako możliwy partner interakcji ogona cytoplazmatycznego metaloproteinazy typu błonowego, MT1-MMP, ale później okazało się, że jest on regulatorem obrotu FA. ZF21 ulega prawie wszechobecnej ekspresji w różnych typach komórek adhezyjnych. Domena FYVE białka ZF21 znajduje się w środku, a C-końcowy region białka zawiera nową fałdę białkową, która jest podobna do domeny PH, ale pozbawiona jest dodatnio naładowanych aminokwasów niezbędnych do wiązania fosfolipidu. Co ciekawe, ZF21 wiąże wiele białek demontujących FA, w tym FAK, β-tubulinę, m-kalpainę i SHP-2. Domena FYVE ZF21 wiąże FAK, a domena PH-like wiąże β-tubulinę. Prawie cały łańcuch polipeptydowy ZF21 jest wymagany do wiązania m-Kalpainy i SHP-2. Substytucja domeny FYVE białka ZF21 odpowiednią domeną pochodzącą od EEA1, innego członka białek zawierających domenę FYVE, znosi jego zdolność do wiązania FAK i znosi jego zdolność do pośredniczenia w indukowanym przez MT demontażu FA .

Wyłączenie ekspresji ZF21 w komórkach zapobiega indukowanemu przez MT demontażowi FA, a także zdarzeniom związanym z demontażem, takim jak deposforylacja FAK przy pTyr397 i internalizacja integryn . Wiązanie ZF21 z FAK jest ważne dla regulacji demontażu FA, ponieważ substytucja domeny FYVE domeną EEA1 znosi zarówno wiązanie FAK, jak i demontaż FA. Domena PH-podobna jest również niezbędna dla aktywności ZF21. Podsumowując, wyniki te sugerują, że ZF21 wiąże się z pęcherzykami endosomalnymi poruszającymi się na MTs poprzez interakcję pomiędzy domeną FYVE a fosfatydyloinozytolo-3-fosforanem w błonie pęcherzyka. Domena PH-like, która pośredniczy w interakcji z β-tubuliną, może pomóc w stabilizacji oddziaływania ZF21 z MTs, a następnie w jeździe na pęcherzykach. Zdolność ZF21 do wiązania SHP-2 i m-kalpainy może ułatwiać transport tych ostatnich do FA poprzez pęcherzyki załadowane na MTs (Figura 5). Po skierowaniu MTs do FAs, ZF21 może zostać przeniesiony do FAs, ponieważ może wiązać FAK, a ZF21 przeniesiony do FAs może następnie zakotwiczyć MTs do FAs. Gab2 w FAs może ułatwiać dephosphorylację FAK przez SHP-2 przenoszony na MTs. Po tych wydarzeniach następuje prawdopodobnie rozpad składników FA przez proteolityczną aktywność m-Calpainy.

Rysunek 5

Model rekrutacji czynników demontażowych do FA. W tym modelu, ZF21 przenosi czynniki demontażu FA poprzez wewnątrzkomórkowy transport pęcherzykowy na MTs. ZF21 łączy się z pęcherzykami endosomalnymi poprzez wiązanie się z fosfatydyloinozytolo(3)-fosforanem za pośrednictwem domeny FYVE. m-Calpaina i SHP-2 mogą być ładowane na ZF21 przenoszone przez pęcherzyki. ZF21 może również znajdować się w FAs poprzez interakcję z FAK, a zdolność ZF21 do wiązania β-tubuliny może pełnić funkcję dokowania rozszerzonych MTs do FAs w celu rozładowania przenoszonych czynników w miejscu przeznaczenia.

Znaczenie ZF21 dla migracji komórek dało nam wskazówkę do zrozumienia jego roli w obrocie FA . Zablokowanie ekspresji ZF21 przez shRNA w komórkach nowotworowych indukowało rozprzestrzenianie się komórek na ECM i tłumiło migrację komórek. Pośredniczona przez integryny adhezja i migracja komórek są ważne podczas inwazji komórek nowotworowych i przerzutów, chociaż struktury podobne do FA nie są wyraźnie rozpoznawalne w większości komórek otoczonych przez ECM. Rzeczywiście, wyłączenie ekspresji ZF21 w ludzkich komórkach raka sutka MDA-MB231 hamuje tworzenie kolonii przerzutowych w płucach po wstrzyknięciu komórek do żyły ogonowej myszy. Możliwe jest jednak, że ZF21 reguluje przerzuty komórek nowotworowych poprzez mechanizmy odmienne od regulacji obrotu FAs.

5. Wnioski

Nasze zrozumienie mechanizmu obrotu FA pozostaje fragmentaryczne. Jednak mechanizmy regulujące migrację komórek w wyniku regulowanej adhezji są kluczowe dla zrozumienia inwazji i przerzutów komórek nowotworowych. Obrót FA jest inicjowany przez rozszerzenie MTs do FAs i zakończony internalizacj± integryn z powierzchni komórki. W proces demontażu FA zaangażowanych jest kilka czynników. W szczególności niedawno zidentyfikowany ZF21 rzucił światło na ten proces, dzięki swojej zdolności do wiązania wielu białek zaangażowanych w demontaż FA. Warto zauważyć, że FA nie są obserwowane w komórkach hodowanych w siatce kolagenowej, co wskazuje, że obecność struktur adhezji komórkowej opartych na integrynach zależy od tego, czy komórki przylegają do sztywnej powierzchni (2D), czy są osadzone w trójwymiarowej ECM (3D). Zaawansowane technologie obrazowania są potężnymi narzędziami do wyjaśnienia dynamicznych ról czynników demontażu FA podczas migracji i inwazji komórek.

.