Strategies employed in the regulation of differentially responsive genes

Mechanizmy regulacji genów przez sygnalizację morfogenów muszą zapewniać sposoby przekładania niewielkich różnic w sile sygnału na reakcje progowe, w których zmiany w ekspresji genów pozwalają na selekcję dyskretnych tożsamości komórkowych w rozwijającej się tkance. Ponad pokolenie temu zaproponowano strategie, które mogłyby wyjaśnić to zjawisko (Monod i Jacob, 1961), a niektóre z tych pomysłów zaczynają się ponownie pojawiać w nowszych badaniach molekularnych. Próbujemy sklasyfikować te strategie jako ogólne cechy budowy, które mogą tłumaczyć zróżnicowaną regulację genów przez stopniowaną sygnalizację (Rys. 2). Oczywiście, kategorie te nakładają się na siebie i lista ta nie jest wyczerpująca. Jest oczywiste, że większość, jeśli nie wszystkie, dobrze zbadane szlaki morfogeniczne wykorzystują kombinację tych mechanizmów do regulacji ekspresji genów docelowych. Aby zilustrować kluczowe cechy każdej z tych strategii, nakreśliliśmy przykłady ich wykorzystania w interpretacji specyficznych przebiegów morfogenów.

Przynależność do miejsca wiązania

Główny mechanizm, który był szeroko badany, wykorzystuje różnice w powinowactwie efektora transkrypcyjnego do wiązania tosyn z różnymi sekwencjami DNA (Ryc.2A). Paradygmatem tego mechanizmu jest gradient Dl we wczesnym zarodku Drosophila, który kieruje kształtowaniem DV i gastrulacją poprzez zależną od stężenia aktywację i represję genów docelowych (Stathopoulos i Levine, 2004). Szeroko zakrojone badania specyficznych enhancerów, które odpowiadają na różne progi Dl, ujawniły szczegółowy obraz mechanizmu regulacji genów. W oparciu o ich reaktywność na Dl, geny docelowe zostały podzielone na różne kategorie. Geny typu I, takie jakstwist (twi), są aktywowane w mezodermie presumptive, gdzie występuje szczytowy poziom jądrowego Dl (ryc. 1C). Wzmacniacze tych genów mają zwykle miejsca wiążące Dl o niskim powinowactwie, które są zajęte tylko przy najwyższym stężeniu Dl, ograniczając w ten sposób ekspresję genów typu I do mezodermy presumptive (Jiang i Levine, 1993). Dla porównania, enhancery genów typu II, takie jak rhomboid (ryc. 1C), zawierają miejsca wiążące Dl o wysokim powinowactwie, które są wiązane i aktywowane przez niższe stężenia Dl obecne w neuroektodermie brzusznej (Ip i in., 1992a). Niedawna analiza komputerowa dużego zbioru enhancerów reagujących na Dl z genomów D. melanogaster i gatunków pokrewnych potwierdziła, że powinowactwo Dla jest głównym czynnikiem determinującym obszary ekspresji genów docelowych Dl (Papatsenko i Levine, 2005). W niektórych przypadkach Dl związany z miejscem o wysokim powinowactwie może również hamować transkrypcję, co wskazuje, że architektura enhancera również odgrywa znaczącą rolę w określaniu reaktywności genów na Dl (Stathopoulos i Levine, 2004). Ponadto, kooperatywne interakcje pomiędzy Dl i innymi czynnikami również znacząco wpływają na reaktywność niektórych genów.

Drugim przykładem jest interpretacja gradientu Bcd, który jest odpowiedzialny za regulację aktywności genów wzdłuż osi anteroposterior (AP) w zarodku Drosophila. Wczesne badania nad interpretacją Bcd wykazały, że powinowactwo miejsc wiążących Bcd jest kluczowym czynnikiem wyznaczającym granice ekspresji docelowego genu hb (ryc. 1B). Zmniejszenie powinowactwa Bcd prowadzi do bardziej ograniczonego do przodu wzorca ekspresji, gdzie poziomy Bcdlevel są wyższe. W ten sposób zaproponowano model interpretacji gradientu Bcd, w którym geny o przednio ograniczonej ekspresji mają miejsca wiążące Bcd o niskim powinowactwie w ich enhancerze i w konsekwencji wymagają wysokiego stężenia Bcd do zajęcia i aktywacji. I odwrotnie, miejsca o wyższym powinowactwie we enhancerze hb umożliwiają ekspresję w bardziej tylnych pozycjach, gdzie stężenie Bcd jest niższe (Driever i in., 1989; Struhl i in., 1989). Na poparcie tego modelu, gen orthodenticle, który jest regulowany przez enhancer o niskim powinowactwie do Bcd, ma wąski wzór ekspresji (Gao i in., 1996) (Ryc. 1B).

Nie tylko w zarodku przedkomórkowym odpowiedź genów na aktywację czynnika transkrypcyjnego wykorzystuje powinowactwo miejsc wiązania. Mechanizm ten jest również istotny w bardziej konwencjonalnych warunkach po komórkowaniu, takich jak interpretacja zewnątrzkomórkowego gradientu Dpp w zarodku Drosophila. W odpowiedzi na szczytowe poziomy sygnalizacji Dpp na grzbietowej linii środkowej zarodka, docelowy gen Race ulega ekspresji w wąskim pasie komórek w przypuszczalnej amnioserosie (Rys. 1D). Odpowiedzialny za tę aktywność enhancer zawiera miejsca wiążące z niskim powinowactwem dla Mad, transkrypcyjnego efektora Dpp. Zmiana tych miejsc w celu zwiększenia powinowactwa do Mad rozszerza związany z tym wzorzec ekspresji na taki, który jest charakterystyczny dla genów reagujących na niższy próg sygnalizacji Dpp (Wharton i in.,2004).

Wejścia kombinatoryczne

Podobieństwo miejsc wiążących może odpowiadać za niektóre z odczytów gradientu morfogenicznego; jednakże, ogólnie rzecz biorąc, samo powinowactwo jest niewystarczające do kierowania pełną gamą odpowiedzi transkrypcyjnych. Na przykład, chociaż powinowactwo miejsc wi±zania Bcd wyznacza granice ekspresji genu docelowego (Driever i in.,1989; Struhl i in.,1989), badania obliczeniowe większej próbki modułów regulacyjnych Bcdcis wskazuj±, że dla większo¶ci z nich istnieje słaba korelacja pomiędzy sił± wi±zania Bcd a granicami ekspresji genu. Co więcej, tylko kilka genów docelowych wydaje się być aktywowanych przez samą Bcd, a ekspresja tych genów jest ograniczona do najbardziej przednich części embrionu, które zawierają szczytowe poziomy Bcd (Ochoa-Espinosa i in., 2005), jak zaobserwowano w przypadku syntetycznego reportera zawierającego tylko miejsca wiążące Bcd (Crauk i Dostatni, 2005). Dla wielu genów głównym czynnikiem determinującym interpretację informacji o położeniu nie jest bezwzględne powinowactwo do Bcd. Zamiast tego, o interpretacji gradientu Bcd mog± decydować inne elementy skierowane do promotorów genów oraz integracja pozytywnych i negatywnych wpływów transkrypcyjnych białek zwi±zanych z tymi elementami. W przypadku genów aktywowanych w środkowych i tylnych regionach zarodka, większość enhancerów genów docelowych Bcd wykazuje tendencję do posiadania dodatkowych wejść od czynników transkrypcyjnych Hb, Caudal (Cad) i/lub Krüppel (Kr) (Ochoa-Espinosa i in., 2005). Hb i Cad ulegają matczynej ekspresji i są zygotycznie aktywowane i represjonowane przez Bcd odpowiednio na poziomie transkrypcyjnym i translacyjnym (Driever i Nusslein-Volhard, 1989; Dubnau i Struhl, 1996; Rivera-Pomaret i in., 1996). Zarówno Hb jak i Cad zwiększają zależną od Bcd aktywację transkrypcyjną (La Rosee etal., 1997; Simpson-Brose etal., 1994). Dlatego też gradient Bcd może funkcjonować wraz z Hb i/lub Cad w celu ustanowienia szerokiej domeny, w której może nastąpić aktywacja enhancera, a równowaga pozytywnych i/lub negatywnych wpływów tych i innych czynników transkrypcyjnych określiłaby granice domeny ekspresji (Ochoa-Espinosa i in., 2005). Represor transkrypcyjny Kr może być jednym z takich negatywnych wpływów, który wyznacza ostrą tylną granicę niektórych celów Bcd (Kraut i Levine, 1991). Podobnie jak miejsca wi±zania dla innych efektorów transkrypcyjnych, rozmieszczenie miejsc wi±zania Bcd również wpływa na ekspresję genów, a dane wskazuj±, że Bcd wi±że się kooperatywnie z DNA. Dlatego wiązanie Bcd do miejsca o wysokim powinowactwie potęguje wiązanie do sąsiedniego miejsca o niskim powinowactwie (Burz i in., 1998). Ekspresja białka Bcd z mutacją zakłócającą kooperatywność w zarodku prowadzi do przesunięcia w przód wzorców ekspresji genów docelowych, takich jak ashb, i zmniejszenia ostrości ich tylnych granic (Lebrecht i in., 2005).

Integracja wejść z Dl i innych czynników transkrypcyjnych również wpływa na odpowiedź genów wzdłuż osi DV embrionu Drosophila. Analiza enhancerów genów docelowych Dl u różnych Drosophilidae (Papatsenko i Levine, 2005) ujawniła, że tak jak geny progowe typu I mają tendencję do niższego powinowactwa do Dla niż geny typu II, tak w tych promotorach istnieje podobna tendencja do powinowactwa do innego czynnika transkrypcyjnego, Twi. Co więcej, geny progowe typu II mają tendencję do stałej orientacji i odstępów między miejscami Dl i Twi. Jest to zgodne z występowaniem synergistycznych oddziaływań pomiędzy czynnikami transkrypcyjnymi Dl i Twi, które są ważne dla aktywacji celów typu II w neurektodermie, gdzie poziomy Dl i Twi są niskie (Papatsenko i Levine, 2005).Wzmacniacze typu II zwykle mają dodatkowe pozytywne wejście od aktywatora Suppressor of Hairless (Erives i Levine, 2004) i negatywne wejście od represora Snail. Snail jest genem docelowym Dl, który jest aktywowany w mezodermie przypuszczalnej (Ip i in., 1992b), wykluczając w ten sposób ekspresję genów typu II z mezodermy (Kosman i in., 1991). W przeciwieństwie do enhancerów typu II, istnieje ujemna korelacja pomiędzy jakością miejsc Dl i Twi we enhancerach typu I, tzn. dobre miejsce Dl jest związane ze słabym miejscem Twi i odwrotnie. Sugeruje to, że w tych enhancerach, w których występuje szczytowy poziom Dl i Twi, aktywatory funkcjonują w sposób kompensacyjny (Papatsenko i Levine, 2005). Co ważne, badania z syntetycznymi enhancerami również wskazują, że obecność miejsc Twi i Dl prowadzi do ostrzejszego wzorca ekspresji, w porównaniu ze słabszym, rozmytym wzorcem, który obserwuje się w przypadku samego Dl (Szymanski i Levine, 1995). Tak więc jasne jest, że oprócz powinowactwa miejsc wiążących dla głównego efektora transkrypcyjnego morfogenu, integracja pozytywnych i negatywnych wejść na enhancer jest ważnym czynnikiem determinującym odpowiedzi progowe (Ryc.2B).

Pętle feed-forward

Włączenie wejść kombinatorycznych do kontroli zróżnicowanej ekspresji genów pozwala na rozwój złożonych relacji regulacyjnych pomiędzy odpowiadającymi genami. Jedną z takich relacji jest pętla feed-forward (Ryc. 2C), której przykład został niedawno opisany dla aktywacji Ras przez sygnalizację Dpps. Poza powinowactwem miejsc wi±ż±cych Mad we wzmacniaczu Race (Wharton i in., 2004), kluczow± rolę w aktywacji Race odgrywa czynnik transkrypcyjny Zerknüllt (Zen). Zen i Mad wiążą się do sąsiednich miejsc we wzmacniaczu Race, a bezpośrednia interakcja między nimi jest niezbędna do aktywacji Race (Xuet al., 2005). zen sam jest genem regulowanym przez Dpp, który zależy od szczytowych poziomów sygnalizacji Dpp (Rushlow i in., 2001). Tak więc, aby Race był indukowany, szczytowe poziomy sygnalizacji Dpp muszą aktywować wysokie poziomy Mad i indukować ekspresję zen, które razem funkcjonują w celu aktywacji Race (Xu etal., 2005). Ten rodzaj genetycznej sieci regulacyjnej, w której czynnik transkrypcyjny X aktywuje czynnik transkrypcyjny Y, a X i Y aktywują cel Z, jest określany jako pętla feed-forward (Lee i in., 2002).

Pętla feed-forward Mad-Zen może reprezentować ogólną strategię, która jest wykorzystywana do aktywacji innych genów docelowych szczytowego Dpp (Xu i in., 2005). Jest pewne, że pętle typu feed-forward działają w innych sieciach genów reagujących na inneorfogeny. Na przykład, Twi, który funkcjonuje z Dl do regulacji genów wzdłuż osi DV, sam jest kodowany przez gen reagujący na Dl (Jiang i Levine, 1993). Występowanie pętli typu feed-forward w interpretacji gradientów morfogenów wczesnych zarodków Drosophila sugeruje, że ten typ obwodu regulacyjnego jest szczególnie odpowiedni do interpretacji gradientów. Dane z innych systemów ujawniają, że pętle typu feed-forward są przydatne do rozróżniania pomiędzy nieregularnymi sygnałami zewnętrznymi, aby zapewnić, że aktywacja następuje tylko w odpowiedzi na stałą sygnalizację, dostarczając w ten sposób środków do buforowania małych fluktuacji sygnału (Shen-Orr i in… 2002), 2002).Moreover, wymóg koincydencji nieodłączne w pętlach feed-forward może alsoprovide bardzo wrażliwe odpowiedzi na małe zmiany w poziomie sygnału (Goldbeter i Koshland, 1984), cecha, która pozwoliłaby odpowiedzi progowe begenerated w odpowiedzi na małe zmiany w początkowej siły sygnalizacji.

Pozytywne sprzężenie zwrotne

Autoregulacja lub pętle pozytywnego sprzężenia zwrotnego (patrzRys. 2D) w genach reagujących mogą również odgrywać rolę w interpretacji gradientu i zapewnić mechanizm generowania wszystkich lub żadnych odpowiedzi na progowych poziomach sygnalizacji. Dobrze scharakteryzowanym przykładem tego jest regulacja Hoxb4 w tylnym mózgu kręgowców (Gould i in.,1998; Gould i in.,1997). Gradient kwasu retinowego (RA) nadaje informacje pozycyjne wzdłuż osi AP formującego się móżdżku kręgowców i jest odpowiedzialny za określenie przedniej granicy indukcji Hoxb4. RA aktywuje jądrowe receptory RA (RAR), a te wiążą się z określonym regionem enhancera w locus Hoxb4, aktywując jego ekspresję. Na wczesnych etapach rozwoju tylnego móżdżku mechanizm ten ustanawia rozproszoną przednią granicę ekspresji Hoxb4. Drugi element wzmacniaj±cy, późny element wzmacniaj±cy, w obrębie locus Hoxb4 odpowiada na samo białko Hoxb4. Dlatego na późniejszych etapach rozwoju, po indukowanej przez RA indukcji Hoxb4, element ten odpowiada na indukowaną Hoxb4 i jest wystarczający do skierowania ekspresji tego genu aż do normalnej przedniej granicy ekspresji genu. Tak więc, stopniowana aktywność RA inicjuje ekspresję Hoxb4, a autoregulacja Hoxb4 przez Hoxb4 udoskonala i utrzymuje jej ekspresję w miarę rozwoju tylnego móżdżku. Hoxb4 reguluje RARβ w podobny sposób, wskazując, że między tymi białkami istnieje obwód wzajemnego dodatniego sprzężenia zwrotnego, który generuje i utrzymuje dyskretne granice ekspresji Hoxb4 (Serpente i in., 2005).

Krzyżowa represja

Represyjne interakcje między genami regulowanymi przez morfogeny są również istotne dla interpretacji gradientu (Ryc. 2E). Dobrze zbadanym przykładem jest udział represji krzyżowej w podziale neuroektodermy Drosophila na trzy kolumny wzdłuż osi DV (Cowden i Levine, 2003). W podziale tym pośredniczą trzy czynniki transkrypcyjne homeobox (Vnd, Ind i Msh), które rozgraniczają odpowiednio kolumny brzuszną, pośrednią i grzbietową. Odmienne progi sygnalizacji D indukują te geny, ale wytwarzanie odrębnych kolumn ekspresji genów, które są ograniczone nagłymi zmianami w ekspresji każdego z białek homeodomenowych, zależy od asymetrycznych krzyżowych interakcji regulacyjnych między tymi białkami. W ten sposób białka homeodomainowe ulegaj± ekspresji w domenach bardziej brzusznych represjonuj± te, które ulegaj± ekspresji bardziej grzbietowej. Thus, incrementalincreases in Dl signalling result in the sequential activation of each geneand in the corresponding repression of the genes induced by lower levels of Dlactivity – a process that has been termed `ventral dominance’.

The vertebrate nervous system displays a variation on this regulatory motifthat involves the use of mutual cross-repression, or reciprocal negativefeedback, between pairs of genes. Komórki w cewce nerwowej kręgowców odpowiadają na stopniowaną sygnalizację Shh poprzez regulację ekspresji serii czynników transkrypcyjnych, które obejmują ortologi homeodomain Vnd, Ind i Msh (Briscoe i Ericson,2001). Na podstawie sposobu regulacji przez sygnalizację Shh, te czynniki transkrypcyjne dzieli się na dwie grupy, określane jako białka klasy I i II. Ekspresja każdego białka klasy I jest wygaszana przy różnych progach aktywności Shh; odwrotnie, ekspresja białek klasy II zależy od sygnalizacji Shh. In vivo, wzorce ekspresji tych genów dzielą cewę nerwową na ostro odgraniczone domeny, przypominające te obserwowane u Drosophila, z brzuszną granicą większości białek klasy I odpowiadającą grzbietowej granicy ekspresji białek klasy II. Osiąga się to dzięki selektywnym krzyżowym interakcjom pomiędzy komplementarnymi parami białek klasy I i klasy II, wyrażonymi w sąsiadujących ze sobą domenach (Briscoe i in.,2001; Briscoe i in.,2000). Zarówno w układzie nerwowym kręgowców, jak i Drosophila (Cowden i Levine, 2003), oddziaływania represyjne ustanawiają progi odpowiedzi genów i generują ostre granice ekspresji genów, które zapewniają, że każda domena progenitorowa wyraża odrębny zestaw czynników transkrypcyjnych. Thismechanism converts a gradient of positional information into discreteall-or-none changes in gene expression.

The principle of cross-regulatory interactions is also observed in otherdeveloping tissues, indicating that it may represent a general strategydeployed to interpret graded positional information. Gradient Bcd określa domeny ekspresji genów Gap, które pozycjonują geny zasad par i polaryzacji segmentów, niezbędne do segmentacji zarodka (Jäckle i in., 1986; Kraut i Levine, 1991). Zarówno asymetryczne, jak i wzajemne oddziaływania represyjne pomiędzy genami Gap wydają się tworzyć skomplikowany obwód. Silna wzajemna represja między parami genów zapewnia wzajemną wyłączność ekspresji, podczas gdy asymetryczna represja przednich genów Gap przez bardziej tylne geny prowadzi do przesunięcia ich tylnych granic ku przodowi (Jaeger i in., 2004; Monk, 2004) (ryc. 2E). Te odkrycia podkreślają dynamiczną cechę interpretacji gradientu Bcd, w której przestrzenne domeny ekspresji genów mogą być repozycjonowane przez kolejne asymetryczne interakcje represyjne między genami Gap.

Odwrotny gradient represorów

Wspólną cechą wielu gradientów morfogenów jest ustanowienie odwrotnego gradientu represora transkrypcji, który jest odwrotny do efektora transkrypcji aktywowanego przez sygnał(Ryc. 2A). W przypadku sygnalizacji Shhand Wnt, podstawowe efektory transkrypcyjne tych szlaków pośredniczą w represji transkrypcyjnej przy braku sygnalizacji, ale są przekształcane w aktywatory transkrypcji po sygnale (Giles i in., 2003; Jacob i Briscoe, 2003). Thenet efekt sygnalizacji, a następnie, jest tworzenie gradientu aktywatora transkrypcji z przeciwstawnym gradientu represora, strategii, która może augmentchanges w aktywności transkrypcyjnej pośredniczących przez morfogenu. Odmianę tej strategii zastosowano w interpretacji gradientu Dpp w tarczy imaginalnej skrzydła Drosophila. Tutaj główną rolą sygnalizacji Dpp wydaje się być tworzenie wzajemnego gradientu białek represorowych Brinker (Brk). Mad i Medea bezpośrednio represjonują Brk w kompleksie z czynnikiem transkrypcyjnym Schnurri (Pyrowolakis i in., 2004), a wrażliwość na represję Brk wyznacza granice ekspresji progowych odpowiedzi Dpp, w tym spalt(sal) i optomotor-blind (omb) (Muller i in., 2003). Ekspresja omb jest represjonowana w klonach mutantów mad z powodu derepresji Brk. Jednakże w klonach z podwójnie zmutowanym klonem brk mad dochodzi do ektopowej aktywacji omb, co wskazuje, że dla ekspresji omb jedynym wymaganiem sygnalizacji Dpp jest represja Brk. Dla kontrastu, ekspresja maksymalnych poziomów sal wymaga pozytywnego wpływu Smads (Affolter i in.,2001; Barrio i de Celis,2004). W innych kontekstach rozwojowych stwierdzono, że Mad i Brk konkurują o te same miejsca wiążące (Affolter i in., 2001), chociaż znaczenie tego faktu dla ustanowienia domen ekspresji genów docelowych skrzydeł jest niejasne.