2.4. Przygotowanie zawiesiny początkowej Candida albicans

Komórki C. albicans hodowane przez 24 h na agarze Sabourauda zawieszono w roztworze soli fizjologicznej (0,85% NaCl) i dostosowano do standardu gęstości 0,5 McFarlanda (1,5 × 108 CFU/mL). Zawiesina ta została następnie rozcieńczona do gęstości 6 × 104 CFU/mL. Zawiesina ta została następnie wykorzystana do oszacowania wartości MIC i MFC dla TTO, terpinen-4-olu i flukonazolu.

2.5. Wyznaczanie wartości MIC i MFC dla TTO i terpinen-4-olu

Aktywność TTO wobec badanych szczepów C. albicans oznaczano metodą makrorozcieńczeń w bulionie z zastosowaniem ogólnych wzorców rozcieńczeń opisanych w normie PN-EN ISO 20776-1:2007 . TTO rozcieńczano seryjnie w płynnej pożywce Sabourauda z 10% Tween 80 do końcowych stężeń TTO od 1% do 0,0075%. Detergent Tween 80 ułatwia rozpuszczanie TTO. Do każdej probówki dodawano taką samą objętość zawiesiny C. albicans, aby uzyskać końcową gęstość 3 × 103 CFU/mL. Po 24 godzinach inkubacji w temperaturze 35°C, wzrost komórek oceniano wizualnie w probówkach z TTO i w probówce z kontrolą pozytywną (bez TTO). MIC zdefiniowano jako najniższe stężenie TTO, które nie prowadziło do widocznego wzrostu badanych szczepów komórkowych. Wartość MFC została zdefiniowana jako najniższe stężenie TTO, które nie powodowało wzrostu kolonii C. albicans. Doświadczenie przeprowadzono trzykrotnie. Wartości MIC i MFC terpinen-4-olu określano identycznie jak opisano powyżej. MIC TTO i terpinen-4-olu wykorzystano do obliczenia subletalnych dawek TTO i terpinen-4-olu stosowanych w kolejnych doświadczeniach.

2.6. Brief Pretreatment of Candida albicans with 1/4 MIC TTO

Dla każdej próbki przygotowano probówkę zawierającą roztwór soli fizjologicznej z 10% Tween 80 i TTO do końcowego stężenia 1/4 MIC TTO. Przygotowano również probówkę kontrolną bez TTO. Następnie do probówek dodawano zawiesinę C. albicans, aby uzyskać końcową gęstość 3 × 103 CFU/mL. Zawiesiny inkubowano w temperaturze 35°C przez 30 minut. Próbki płukano dwukrotnie i odwirowywano pomiędzy płukaniami (3000 ×g, 15 minut), a komórki ponownie zawieszano do gęstości 6 × 104 CFU/mL. Następnie zawiesinę wykorzystano do oznaczenia MIC flukonazolu i minimalnego stężenia grzybobójczego (MFC) flukonazolu. Badania wykonano w trzech egzemplarzach.

2.7. Oznaczanie wartości MIC i MFC flukonazolu po krótkim wstępnym poddaniu Candida albicans działaniu 1/4 MIC TTO

Aktywność flukonazolu wobec badanych szczepów C. albicans oznaczano metodą makrorozcieńczeń w bulionie z zastosowaniem ogólnych wzorców rozcieńczeń zgodnie z PN-EN ISO 20776-1:2007 . W płynnym podłożu Sabourauda przygotowywano seryjne, równoległe rozcieńczenia flukonazolu w zakresie od 256,0 μg/mL do 0,125 μg/mL oraz dołączano probówkę kontrolną bez leku. Do każdej z probówek dodawano taką samą objętość zawiesiny komórek C. albicans wstępnie traktowanych 1/4 MIC TTO, a inokulum doprowadzano do ostatecznej gęstości 3 × 103 CFU/mL. Po 24 h inkubacji w temperaturze 35°C wzrost komórek w każdej probówce był oceniany wizualnie. Wartość MIC definiowano jako najniższe stężenie flukonazolu, które nie powodowało widocznego wzrostu badanych szczepów. Komórki z probówki zidentyfikowanej jako MIC, jak również z kilku otaczających ją rozcieńczeń, były posiewane na agar Sabourauda. Po 24 h inkubacji w temp. 35°C liczono kolonie C. albicans. Wartość MFC zdefiniowano jako najniższe stężenie flukonazolu, które nie wykazało wzrostu kolonii C. albicans. Doświadczenie przeprowadzono w trzech powtórzeniach. Szczepy C. albicans sklasyfikowano jako wykazujące wrażliwość, pośrednią wrażliwość lub oporność na flukonazol zgodnie z dokumentem CLSI M27-A3-2008 , jak opisano w punkcie 2.1.

2.8. Prolonged Pretreatment of Candida albicans with Fluconazole and Sublethal Dose of TTO or Terpinen-4-ol

Seryjne, równoległe rozcieńczenia flukonazolu w zakresie od 256,0 μg/mL do 0,125 μg/mL przygotowano w płynnym podłożu hodowlanym Sabourauda. Dołączono dwie kontrole pozytywne. Wszystkie probówki zawierały 10% Tween 80, a do każdego rozcieńczenia i jednej z probówek kontrolnych dodawano TTO, aby uzyskać końcowe stężenie 1/4 MIC TTO. Druga probówka kontrolna zawierała tylko płynną pożywkę. Następnie do każdej probówki dodawano równą objętość zawiesiny C. albicans do końcowej gęstości 3 × 103 CFU/mL. Wszystkie probówki inkubowano w temperaturze 35°C przez 24 h. Po inkubacji wzrost komórek w każdej probówce oceniano wizualnie i określano wartości MIC i MFC flukonazolu, jak opisano wcześniej. Komórki z probówki zidentyfikowanej jako MIC, jak również z kilku otaczających ją rozcieńczeń, były posiewane na agar Sabourauda. Po 24 h inkubacji w temp. 35°C liczono kolonie C. albicans i określano wartość MFC flukonazolu. Doświadczenie przeprowadzono w trzech powtórzeniach. Przedłużone wstępne traktowanie C. albicans flukonazolem i terpinen-4-olem przeprowadzono identycznie jak opisano powyżej.

2.9. Metody statystyczne

Wyniki przedstawiono jako średnią arytmetyczną i medianę. Różnice statystyczne między wartościami średnimi określono testem Studenta oraz testem Manna-Whitneya, w zależności od zgodności wyników z rozkładem normalnym. Za istotne statystycznie uznano wartości równe. Do analiz statystycznych wykorzystano program STATISTICA wersja 10 (StatSoft, Kraków, Polska).

3. Wyniki

Badane szczepy Candida albicans były oporne na flukonazol i wrażliwe na niskie stężenia TTO. Kliniczne szczepy C. albicans oraz szczep referencyjny C. albicans ATCC 10231, badane metodą dyfuzyjno-krążkową Kirby-Bauera, nie wykazywały strefy zahamowania wzrostu. Wszystkie badane szczepy C. albicans zaklasyfikowano jako wykazujące oporność na flukonazol. Wartości MIC flukonazolu dla 32 klinicznych szczepów C. albicans wahały się od 64,0 μg/mL do 256,0 μg/mL (średnia = 244,0 ± 47,22 μg/mL). Najczęściej występującymi wartościami były 256,0 μg/mL (30 szczepów) i 64,0 μg/mL (2 szczepy). Dla szczepu referencyjnego C. albicans ATCC 10231 MIC flukonazolu wynosił 256,0 μg/mL.

Mikrogramy TTO dla 32 klinicznych szczepów C. albicans wahały się od 0,06% do 0,5% (średnia = 0,19 ± 0,09%). Najczęściej występującymi wartościami były 0,125% (15 szczepów) i 0,25% (15 szczepów). Wartości MIC TTO dla dwóch pozostałych szczepów wynosiły 0,06% i 0,5%. Dla szczepu referencyjnego C. albicans ATCC 10231 wartość TTO MIC wynosiła 0,125%. Wyniki te wskazują, że badane szczepy C. albicans nie wykazywały oporności krzyżowej na TTO i flukonazol. Wartości MIC TTO wykorzystano do obliczenia dawek subletalnych (1/4 MIC TTO) stosowanych w pozostałej części badania.

Krótkie wstępne traktowanie 32 klinicznych szczepów C. albicans i szczepu referencyjnego C. albicans ATCC 10231 dawką 1/4 MIC TTO nie zmieniło wartości MIC i MFC flukonazolu. Ekspozycja szczepów C. albicans na 1/4 MIC TTO i flukonazol przez 24 godziny (przedłużona obróbka wstępna) istotnie zwiększyła wrażliwość szczepów drożdżaków na flukonazol. Spośród 32 szczepów klinicznych C. albicans opornych na flukonazol, 28 szczepów (87,5%) wykazywało następnie wysoką lub pośrednią wrażliwość na flukonazol (tab. 2).

Ekspozycja opornych na flukonazol szczepów C. albicans przez 24 h na 1/4 MIC TTO i flukonazol zwiększyła aktywność flukonazolu wobec tych szczepów. Ogółem 62,5% izolatów sklasyfikowano jako wrażliwe, 25,0% wykazywało pośrednią wrażliwość, a 12,5% było opornych. Dla wszystkich badanych szczepów klinicznych, średnie MIC flukonazolu zmniejszyło się z 244,0 μg/mL do 38,46 μg/mL po przedłużonej obróbce wstępnej, a średnia MFC flukonazolu zmniejszyła się z 254,67 μg/mL do 66,62 μg/mL (Tabela 3). Wartości MIC i MFC dla szczepów wrażliwych () i szczepów o pośredniej wrażliwości () były statystycznie niskie w porównaniu z analogicznymi wartościami uzyskanymi dla próbki kontrolnej i dla próbek poddanych jedynie krótkiej obróbce wstępnej z użyciem TTO. Dla grupy izolatów wrażliwych MIC flukonazolu obniżyło się średnio do 0,52 μg/mL, a MFC flukonazolu do średnio 4,25 μg/mL. Przedłużone wstępne traktowanie szczepu wzorcowego Candida albicans ATCC 10231 preparatem TTO i flukonazolem w dawce 1/4 MIC nie zwiększyło wrażliwości tego szczepu na flukonazol, podobnie jak czterech badanych klinicznych szczepów C. albicans opornych na flukonazol.

Terpinen-4-ol, główny bioaktywny składnik obecny w TTO, silnie wzmacniał aktywność flukonazolu wobec szczepów C. albicans opornych na flukonazol. MIC terpinen-4-olu dla klinicznych szczepów C. albicans wahały się od 0,06% do 0,25% (średnio = 0,11 ± 0,09%). Dla standardowego szczepu C. albicans ATCC 10231 MIC terpinen-4-olu wynosił 0,06%. Badane szczepy C. albicans nie wykazywały oporności krzyżowej na terpinen-4-ol i flukonazol. Ekspozycja klinicznych i wzorcowych szczepów C. albicans opornych na flukonazol przez 24 h na flukonazol i subletalne dawki (1/4 MIC) terpinen-4-olu silnie wzmocniła aktywność flukonazolu wobec tych szczepów, a wszystkie izolaty C. albicans zostały zakwalifikowane jako wrażliwe (MIC flukonazolu obniżyło się do 0,125 μg/mL). Podsumowaliśmy wyniki tego badania, a najważniejsze dane przedstawiliśmy w formie tabeli (Tabela 4).

4. Dyskusja

TTO jest najczęściej stosowanym olejkiem eterycznym ze względu na swoje właściwości przeciwbakteryjne i przeciwgrzybicze. W tym badaniu ocenialiśmy zmianę aktywności flukonazolu in vitro wobec opornych na flukonazol klinicznych szczepów Candida albicans narażonych na subletalne stężenia TTO lub terpinen-4-ol, głównego bioaktywnego składnika TTO. Wcześniejsze badania in vitro wrażliwości Candida spp. na TTO wykazały, że TTO jest wysoce aktywny wobec tych drobnoustrojów, a także szczepów opornych na azole, dla których MIC TTO wahał się od 0,25% do 0,5% . Dla szczepów C. albicans, które były oporne zarówno na flukonazol, jak i itrakonazol, wartości MIC TTO wahały się od 0,25 do 1,0%, MIC50 TTO wynosił 0,5%, a MIC90 TTO wynosił 1%. W innym badaniu wykazano, że trzy kliniczne szczepy C. albicans oporne na flukonazol miały bardzo niskie MIC TTO (0,15% dla dwóch szczepów i 0,07% dla trzeciego szczepu) .

Doświadczenia przeprowadzone w tym badaniu potwierdzają wyniki z wcześniej opublikowanych badań, w których wszystkie badane szczepy C. albicans oporne na flukonazol były wrażliwe na TTO . Oznaczone MIC TTO były niskie i wahały się od 0,06% do 0,5%. Aktywność przeciwbakteryjną TTO przypisuje się głównie terpinenowi-4-olowi, głównemu bioaktywnemu składnikowi obecnemu w TTO. Wyznaczone wartości MIC dla terpinen-4-olu były bardzo niskie i wahały się od 0,06% do 0,25%. Nasze badania oraz inne badania wskazują, że C. albicans nie wykazuje oporności krzyżowej na TTO i środki azolowe. Nie odnotowano oporności klinicznej na TTO. Wieloskładnikowa natura TTO może zmniejszyć potencjał spontanicznego powstawania oporności, a do pokonania wszystkich działań przeciwdrobnoustrojowych każdego ze składników może być wymagane wiele jednoczesnych mutacji. Dlatego TTO może być stosowany jako miejscowy środek antyseptyczny do skutecznego leczenia powierzchownych grzybic wywołanych przez oporne na flukonazol Candida spp. i inne drożdżaki oporne na azole. Niestety, TTO może być potencjalnie toksyczny po spożyciu dużych dawek, dlatego też TTO nie powinien być podawany doustnie. Ostra toksyczność doustna TTO jest podobna do toksyczności doustnej innych powszechnie stosowanych olejków eterycznych, na przykład takich jak olejek eukaliptusowy . Lipofilny charakter TTO, który umożliwia mu przenikanie przez zewnętrzne warstwy skóry, potęguje nie tylko działanie antyseptyczne, ale także możliwość toksycznego działania TTO w wyniku wchłaniania przez skórę. TTO może powodować podrażnienia skóry przy wyższych stężeniach, a u osób predysponowanych może wywoływać reakcje alergiczne. Zhang i Robertson zaobserwowali ototoksyczne działanie 100% TTO. Toksyczność TTO jest zależna od dawki, a większość zdarzeń niepożądanych można uniknąć poprzez stosowanie TTO w postaci rozcieńczonej. TTO nie jest mutagenny lub genotoksyczny.

Wzrasta zainteresowanie nie tylko aktywnością substancji naturalnych przeciwko opornym mikrobom, ale także synergicznymi interakcjami między tymi substancjami a konwencjonalnymi lekami. Flukonazol jest jednym z azolowych leków przeciwgrzybiczych szeroko stosowanych zarówno w profilaktyce, jak i terapii zakażeń wywołanych przez Candida. W niniejszej pracy badaliśmy zmiany w aktywności flukonazolu wobec opornych na flukonazol szczepów C. albicans po ekspozycji na subletalne stężenia TTO lub terpinen-4-olu. Użyliśmy wyłącznie szczepów opornych na flukonazol, ponieważ zidentyfikowanie synergistycznego działania na te szczepy byłoby szczególnie ważne. Testowaliśmy subletalne stężenia TTO i terpinen-4-olu, ponieważ spodziewaliśmy się, że stężenia niższe niż MIC osłabią strukturę komórkową bez zabijania komórek, ułatwiając działanie flukonazolu i w konsekwencji hamując oporność C. albicans na flukonazol. Nasze wyniki wskazują, że krótkotrwała (0,5 h) ekspozycja opornych na flukonazol szczepów C. albicans na subletalne stężenie TTO (1/4 MIC TTO) nie miała wpływu na aktywność przeciwgrzybiczą flukonazolu. Natomiast poddanie komórek C. albicans działaniu subletalnego stężenia TTO, a następnie traktowanie ich flukonazolem hamowało oporność na flukonazol u 87,5% badanych szczepów. Wyniki te sugerują, że istnieje synergistyczne oddziaływanie pomiędzy flukonazolem i TTO wobec C. albicans opornych na flukonazol. TTO zastosowano do permeabilizacji błon komórkowych drożdży, wyraźnie zwiększając ich wrażliwość na flukonazol. TTO wbudowując się w błonę dwuwarstwy lipidowej, zaburza jej strukturę, co skutkuje zwiększoną przepuszczalnością i upośledzeniem funkcji fizjologicznych. TTO hamuje również tworzenie się strzępek zarodkowych lub przekształcanie grzybni u C. albicans oraz hamuje oddychanie u C. albicans w sposób zależny od dawki. Komórki grzybów wystawione na działanie TTO ulegają w końcu rozerwaniu. Subletalne stężenia TTO osłabiają również żywotność komórek Candida spp. Mechanizm działania przeciwgrzybiczego flukonazolu jest odmienny. Wykazano, że flukonazol zaburza działanie zależnego od cytochromu P-450 enzymu C-14α-demetylazy, który jest odpowiedzialny za produkcję ergosterolu. Zaburzenie syntezy ergosterolu powoduje zmiany strukturalne i funkcjonalne w błonie komórkowej grzyba, które predysponują komórki grzyba do uszkodzenia. Dodatkowym działaniem przeciwgrzybiczym flukonazolu jest hamowanie enzymów oksydacyjnych i peroksydacyjnych cytochromu. Opisano kilka mechanizmów oporności na flukonazol u izolatów C. albicans: zwiększona produkcja 14α-demetazy lanosterolu kodowanej przez gen ERG11 i zmniejszenie powinowactwa 14α-demetazy lanosterolu do flukonazolu w wyniku mutacji w genie ERG11 oraz defekt desaturazy Δ5-6 kodowanej przez gen ERG3 powodujący utratę funkcji w szlaku ergosterolowym. Innym mechanizmem oporności na flukonazol u C. albicans jest aktywny transport leków przez błonę plazmatyczną za pośrednictwem „pomp efflux”, co wymaga ekspresji genów CDR1/2 i MDR1. Wywołane przez TTO uszkodzenie błony komórkowej może zaburzać funkcję „pomp efflux”, czyniąc w ten sposób komórkę grzyba bardziej podatną na flukonazol.

Nasze dane wskazują, że istnieje synergistyczny efekt in vitro subletalnych stężeń TTO i flukonazolu wobec szczepów C. albicans opornych na flukonazol. Natomiast w przypadku szczepu standardowego C. albicans ATCC 10231 opornego na flukonazol oraz czterech szczepów klinicznych C. albicans nie obserwowano wzrostu wrażliwości na flukonazol. Prawdopodobną przyczyną tego efektu były różnice w mechanizmach oporności tych szczepów na flukonazol. W naszych badaniach in vitro główny składnik TTO – terpinen-4-ol był bardziej aktywny niż TTO i silnie wzmacniał aktywność flukonazolu wobec wszystkich badanych szczepów C. albicans opornych na flukonazol. Mondello i wsp. oraz Ninomiya i wsp. zaobserwowali, że in vivo TTO i terpinen-4-ol wykazywały podobną skuteczność w zwalczaniu kandydozy wywołanej przez C. albicans oporne na azole. Mechanizmy synergizmu działania flukonazolu i TTO nie zostały wyjaśnione. Yu i wsp. potwierdzili synergizm działania flukonazolu i triclosanu wobec klinicznych izolatów C. albicans opornych na flukonazol. Liu i wsp. zaobserwowali synergistyczne działanie flukonazolu i glabrydyny wobec C. albicans związane z wpływem glabrydyny na otoczkę komórkową. Ahmad i wsp. opisali synergistyczne działanie tymolu i karwakrolu z flukonazolem wobec izolatów Candida. Oba monoterpeny hamowały efflux o 70-90%, co wskazuje na ich wysoką zdolność do blokowania pomp transportujących leki.

Wcześniejsze badania oceniały również aktywność TTO wobec różnych mikroorganizmów w połączeniu z innymi substancjami przeciwbakteryjnymi. Zaobserwowano efekt synergistyczny dla itrakonazolu i TTO w termoczułym żelu stosowanym w leczeniu kandydozy pochwy. Efekty synergistyczne zaobserwowano również pomiędzy olejkami eterycznymi a ciprofloksacyną, gentamycyną, cefiksymem i prystynamycyną. W teście dyfuzyjnym z użyciem krążków z C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis, C. krusei, C. guilliermondii i C. parapsilosis, większe strefy zahamowania wzrostu występowały wokół krążków impregnowanych TTO i amfoterycyną B niż wokół krążków zawierających tylko TTO . W badaniu Staphylococcus aureus, większe strefy zahamowania wzrostu wystąpiły wokół krążków impregnowanych TTO i innymi olejkami eterycznymi w porównaniu do krążków impregnowanych tylko TTO .

Synergistyczne działanie substancji przeciwdrobnoustrojowych zostało również wykazane przy użyciu krzywych czasowych. Krótka obróbka wstępna Pseudomonas aeruginosa z substancją, która zakłóca błonę cytoplazmatyczną (cyjanek karbonylu m-chlorofenylohydrazon, nonapeptyd polimyksyny B lub kwas etylenodiaminotetraoctowy) wzmocniła bakteriobójczą aktywność TTO, jak wykazano w zwiększonej szybkości zabijania mikroorganizmów na krzywych czasowych. Jednakże, w badaniu z zastosowaniem metody E-test, Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus i gronkowce koagulazoujemne (CoNS) narażone na subletalne stężenia TTO przez 72 godziny wykazywały zwiększoną oporność na gentamycynę, streptomycynę, chloramfenikol, tetracyklinę, erytromycynę, trimetoprim, ampicylinę, kwas fusydowy, mupirocynę, linezolid i wankomycynę. Zwiększoną aktywność przeciwdrobnoustrojową zaobserwowano, gdy olejki eteryczne połączono z ich wyizolowanymi składnikami (np. terpinen-4-ol z Melaleuca alternifolia) oraz gdy TTO połączono z jonami srebra .

Wskaźnik frakcyjnego stężenia hamującego (FIC), określany również jako FICI, służy do określenia, czy dwie substancje są synergistyczne czy antagonistyczne. Wartości FIC mogą być różnie interpretowane, jednak ogólnie rzecz biorąc, indeks FIC niższy niż 0,5 wskazuje na synergizm, a indeks FIC wyższy niż 4 wskazuje na antagonizm. Wartość indeksu FIC dla TTO i tobramycyny wynosiła 0,37 dla Escherichia coli i 0,62 dla Staphylococcus aureus, co wskazuje, że te dwie substancje działają synergistycznie. Niewielki efekt synergistyczny obserwowano w przypadku leczenia Candida albicans za pomocą TTO i amfoterycyny B oraz Klebsiella pneumoniae za pomocą TTO i ciprofloksacyny. TTO i ciprofloksacyna wykazują działanie antagonistyczne wobec Staphylococcus aureus . Nie stwierdzono efektu synergistycznego pomiędzy TTO i lizostafiną, mupirocyną, gentamycyną lub wankomycyną w stosunku do metycylinoopornych szczepów Staphylococcus aureus. W rzeczywistości, wskaźnik FIC wskazał, że TTO i wankomycyna są antagonistyczne .

Wyniki tego badania i innych wcześniejszych badań pokazują, że połączenie substancji naturalnych, takich jak TTO i konwencjonalnych leków, takich jak flukonazol, może pomóc w leczeniu trudnych infekcji drożdżakowych. Potrzebne są jednak dodatkowe badania in vitro w celu identyfikacji aktywności przeciwdrobnoustrojowej naturalnych substancji leczniczych i wykrycia synergistycznych interakcji z powszechnie stosowanymi środkami przeciwdrobnoustrojowymi.

Konflikt interesów

Autorzy deklarują, że nie ma konfliktu interesów w związku z publikacją tej pracy.

Podziękowania

Autorzy pragną podziękować firmie MELALEUCA w Gliwicach (Polska) za uprzejme przekazanie olejku z australijskiego drzewa herbacianego otrzymywanego z Melaleuca alternifolia, firmie Polfarmex w Kutnie (Polska) za uprzejme przekazanie flukonazolu oraz Laboratorium Mikrobiologicznemu LABOMED w Gliwicach (Polska) za uprzejme przekazanie klinicznych szczepów Candida albicans użytych w niniejszej pracy.