Jellyfish genome assembly and annotation

Here, we present the first de novo genome assembly of the Nomura’s jellyfish (Nemopilema nomurai; Fig. 1b). W rezultacie otrzymaliśmy 213-Mb genom składający się z 255 rusztowań o długości N50 wynoszącej 2,71 Mb, zawierający jedynie 1,48% luk (plik dodatkowy 1: tabele S2 i S3). Hybrydową asemblację Nemopilema utworzono przy użyciu kombinacji technologii sekwencjonowania krótkich i długich odczytów, składającej się z 38,2 Gb odczytów SMRT (single-molecule real-time sequencing) firmy Pacific Biosciences (PacBio) oraz 98,6 Gb syntetycznych długich odczytów TruSeq (plik dodatkowy 1: ryc. S3-S5; tabele S4-S7). Powstała w ten sposób asocjacja wykazuje najdłuższą ciągłość wśród genomów knidarian (plik dodatkowy 1: Tabela S9). Przewidzieliśmy 18 962 geny kodujące białka meduz, łącząc metody przewidywania genów de novo (z wykorzystaniem transkryptomów tkanki dzwonka meduzy i macki) oraz metody przewidywania genów homologicznych (plik dodatkowy 1: tabele S10 i S11, pliki dodatkowe 2 i 3). W wyniku tego procesu odzyskano największą liczbę jednokopijnych genów ortologicznych spośród wszystkich opublikowanych do tej pory zespołów genomów metazoanów niebiałkowych (plik dodatkowy 1: Tabela S12). Stwierdzono, że 21,07% genomu meduzy składa się z elementów transpozycyjnych, w porównaniu z genomami Acropora digitifera (9,45%), Nematostella vectensis (33,63%) i Hydra vulgaris (42,87%) (plik dodatkowy 1: Tabela S13).

Porównaliśmy genom Nemopilema z genomami innych cnidarian, w tym niedawno opublikowanymi genomami Aurelia aurita i Clytia hemisphaerica, z których wszystkie pochodzą od taksonów głównie osiadłych, aby wykryć unikalne funkcje Scyphozoa (aktywna mobilność), strukturę fizyczną (dzwon meduzy) i chemię (jad). Przeprowadziliśmy również analizy transkryptomu zarówno Nemopilema nomurai, jak i meduzy Sanderia malayensis w trzech typach tkanek meduzy i czterech stadiach rozwojowych.

Analiza ewolucyjna meduzy

Aby zidentyfikować cechy ewolucyjne specyficzne dla meduzy, zbadaliśmy ekspansje i kurczenie się rodzin genów u jednego jednokomórkowego holozoana i 13 metazoanów, używając 18 458 ortologicznych rodzin genów (patrz plik dodatkowy 1: sekcja 4.1). Spośród nich 10 434 znaleziono u Nemopilema, a 6764 były wspólne dla wszystkich trzech dostępnych klas gromad gromadnych gnid (Scyphozoa: Nemopilema nomurai i Aurelia aurita; Hydrozoa: Hydra vulgaris , Clytia hemisphaerica; Anthozoa: Acropora digitifera i Nematostella vectensis ; Fig. 2a). Filogeneza skonstruowana z wykorzystaniem tych ortologów ujawniła monofiletyczny klad knidarian, który oddzielił się od metazoanowego pnia przed ewolucją bilaterii (ryc. 2b; plik dodatkowy 1: ryc. S7). Aby określić, ile genów pojawiło się w każdej epoce ewolucyjnej w genomie meduzy Nomura, oceniliśmy również wiek ewolucyjny genów kodujących białka. Grupując geny meduz do trzech szerokich er ewolucyjnych, zaobserwowaliśmy, że podczas gdy większość (80%) genów jest starożytna (starsza niż 741 Mya), kilka (~ 3%) jest w wieku pośrednim (741-239 Mya), a niektóre (17%) są młode (239 Mya do chwili obecnej; Fig. 2c; Dodatkowy plik 1: Figura S10). Co ciekawe, normalizacja liczby genów według wieku i długości ery ewolucyjnej sugeruje, że rotacja genów jest największa w pobliżu obecnego czasu. W sumie, genom Nemopilema zawierał 123 rozszerzone i 164 skurczone rodziny genów w porównaniu do wspólnego przodka Nemopilema i Aurelia (ryc. 2b; patrz plik dodatkowy 1: sekcja 4.2). Terminy Gene Ontology (GO) związane z percepcją sensoryczną były słabo reprezentowane w linii Cnidaria w porównaniu z Bilateria, co dokładnie odzwierciedla mniej skomplikowany system sensoryczny cnidarian (plik dodatkowy 1: tabele S14 i S15). Jednakże transport neuroprzekaźników (GO:0006836, P = 6.01E- 10) był znacząco wzbogacony w linii Scyphozoa w porównaniu do wspólnego przodka Scyphozoa i Hydrozoa (plik dodatkowy 1: tabele S16 i S17), prawdopodobnie ze względu na równowagę i struktury wzrokowe, takie jak statocysta i okulary, które są bardziej rozbudowane u ruchomej meduzy niż u polipów osiadłych. W porównaniu do wspólnego przodka Nemopilema i Aurelia, Nemopilema wykazała rozszerzone rodziny genów związanych z aktywnością metalopeptydaz (GO:0008237, P = 2.86E- 14; Dodatkowy plik 1: Tabele S18 i S19). Dodatkowo, znaleźliśmy 1589 ortologicznych rodzin genów, które są specyficzne dla Scyphozoa. Testy wzbogacania genów specyficznych dla scyfozoanów wykazały terminy transportu jonów sodu, aktywności kanałów jonowych i aktywności receptorów neuroprzekaźników (plik dodatkowy 1: Tabela S20).

Kontekst genomiczny i geny związane z mięśniami

Meduzy mają dwa podstawowe typy mięśni: komórki epitelomięśniowe, które są dominującymi komórkami mięśniowymi występującymi u knidriowatych wysuniętych na brzeg, oraz komórki mięśni prążkowanych zlokalizowane w dzwonku meduzy, które są niezbędne do pływania. Aby zrozumieć ewolucję aktywnego pływania u meduz, zbadaliśmy ich uprzedzenia kodonowe w porównaniu do innych metazoanów, obliczając zawartość guaniny i cytozyny w trzeciej pozycji kodonu (GC3) (plik dodatkowy 1: Rysunek S13). Sugeruje się, że geny o wysokim poziomie GC3 są bardziej przystosowane do zewnętrznych stresów (np. zmian środowiskowych). Wśród 100 najwyżej punktowanych genów GC3, regulacji skurczu mięśni i neuropeptydowych szlaków sygnałowych, terminy GO były specyficzne dla Nemopilema (plik dodatkowy 4: tabele S25 i S26). Wapń odgrywa kluczową rolę w skurczu mięśni prążkowanych u meduz, a ścieżka sygnalizacji wapnia (GO:0004020, P = 5.60E- 10) wykazała wysoki poziom GC3 bias specyficzny dla Nemopilema. Pierwsze 500 genów GC3 Nemopilema i Aurelia było wzbogaconych w terminy GO związane z homeostazą (np, komórkowa homeostaza chemiczna i transport jonów sodu), co jak przypuszczamy jest niezbędne do aktywacji skurczów mięśni, które napędzają mobilne drapieżnictwo meduzy (Dodatkowy plik 1: sekcja 5.1; Dodatkowy plik 4: tabele S27 i S28).

Ponieważ u knidriowate odnotowano brak kompleksów titiny i troponiny, które są krytycznymi składnikami mięśni prążkowanych bilateralnych, sugerowano, że te dwa klady niezależnie wyewoluowały mięśnie prążkowane. Badanie genów kodujących strukturalne i regulacyjne białka mięśniowe u knidriowate wykazało, że eumetazoński rdzeń aktynowo-miozynowej maszynerii kurczliwej jest wspólny z bilateralnymi (plik dodatkowy 1: Tabela S32). Jednakże, podobnie jak u innych knidriowate, w Nemopilema brakuje kompleksów titiny i troponiny, które są kluczowymi składnikami mięśni poprzecznie prążkowanych u dwudysznych. Również γ-syntrofina, składnik kompleksu dystroglikanu, była nieobecna w Nemopilema, Aurelia i Hydra. Jednakże Nemopilema i Aurelia posiadają α/β-Dystrobrevin i α/ε-Sarcoglycan dystroglikan-associated costamere proteins, co wskazuje, że kilka składników kompleksu dystroglikanu zostało utraconych po podziale Scyphozoa-Hydrozoa. Zasugerowano, że Hydra uległa wtórnemu uproszczeniu w stosunku do Nematostella, która ma większy stopień specjalizacji typu komórek mięśniowych. W porównaniu z Hydra i Nematostella, Nemopilema i Aurelia wykazują pośrednią złożoność mięśniowych białek strukturalnych i regulacyjnych pomiędzy Hydra i Nematostella.

Profilowanie transkryptomu dzwonków i macek meduz

Brzuch i macki meduz są morfologicznie odrębne i pełnią dyskretne funkcje fizjologiczne. Wygenerowaliśmy transkryptomy dzwonków i macek z Nemopilema i mniejszej Sanderia malayensis, które mogą być hodowane w laboratorium, w celu oceny regulacji rozwoju (plik dodatkowy 1: Tabela S29). Testy wzbogacania wysoko wyrażonych genów wykazały, że kategorie funkcjonalne związane z mięśniami (np. kompleks miozyny mięśniowej i morfogeneza tkanki mięśniowej) były wzbogacone w dzwonku (Fig. 3a; plik dodatkowy 5: tabele S30-S33). Miozyny należą do nadrodziny białek motorycznych i odgrywają krytyczną rolę w skurczu mięśni oraz są zaangażowane w szeroki zakres procesów ruchowych u Eukaryota. Białka rodziny miozyny II, występujące w komórkach zarówno tkanki mięśniowej poprzecznie prążkowanej, jak i gładkiej, są odpowiedzialne za wytwarzanie skurczu w komórkach mięśniowych. Ślimaki posiadają zarówno komórki nabłonkowo-mięśniowe, jak i komórki mięśni prążkowanych. Mięsień prążkowany jest krytycznym składnikiem podbrzusza meduzy, gdzie jego szybkie skurcze napędzają unikalne, oparte na napędzie pływanie meduzy. Stwierdziliśmy, że rodziny genów typu II łańcucha ciężkiego miozyny (MYH) i łańcucha lekkiego miozyny (MYL) ulegają wysokiej ekspresji w dzwonku i są ściśle związane z komórkami mięśni prążkowanych i gładkich. Co ciekawe, Nemopilema i Aurelia wykazywały największą liczbę kopii genów MYH i MYL wśród niebilateralnych metazoanów (ryc. 3c; plik dodatkowy 1: ryc. S14-S17; tabele S38-40), a sześć z siedmiu genów MYH i 12 z 21 genów MYL w Nemopilema wykazywało wyższą ekspresję w dzwonku niż w mackach, z bardzo wysokim ~ 8,8 i ~ 17-krotnym wzrostem, odpowiednio (ryc. 3d). Wyniki te sugerują, że kombinacje ekspansji liczby kopii rodzin genów miozyny typu II i wysokiej ekspresji genów związanych z mięśniami potwierdziły, że mięśnie w dzwonku meduzy są ważnym czynnikiem determinującym ruchliwość meduzy.

Odwrotnie, analizy ekspresji genów w mackach ujawniły wysoki poziom ekspresji RNA kategorii funkcjonalnych związanych z neuroprzekaźnikami (kompleks kanałów jonowych, postsynapse i aktywność receptora neuroprzekaźnika; Fig. 3b; plik dodatkowy 5: tabele S34-S37); spójne z anatomią macek meduzy, które zawierają komórki czuciowe i luźny splot subpopulacji neuronów u podstawy ektodermy .

Wzorowanie ciała u meduzy

Wokół wczesnej ewolucji wzorowania ciała u wspólnego przodka metazoanów toczy się wiele debat, szczególnie dotyczących pochodzenia i ekspansji rodzin genów Hox i Wnt . W sumie 83 homeodomeny znaleziono u Nemopilema, podczas gdy 82, 41, 120 i 148 homeodomen znaleziono odpowiednio u Aurelia, Hydra, Acropora i Nematostella (plik dodatkowy 1: Tabela S41). Pięć z ośmiu genów Hox u Nemopilema to geny typu tylnego, które są związane z rozwojem osi aboralnej i grupują się z tylnymi genami Hox Nematostella, HOXE i HOXF (plik dodatkowy 1: ryc. S18-S20). Aurelia ma sześć genów Hox typu tylnego, ale nie ma genów typu HOXB, C i D (HOX2 u ludzi). Choć nieobecne u Hydry i Acropora, analizy syntenii genów ParaHox u Nemopilema wykazują, że gen XLOX/CDX znajduje się bezpośrednio za GSX w tym samym tandemie, co geny u Nematostella, co sugeruje, że XLOX/CDX były obecne u wspólnego przodka cnidarian, a następnie zostały utracone w niektórych lineażach (plik dodatkowy 1: ryc. S21). Geny związane z Hox, EVX i EMX, są również obecne u Nemopilema i Aurelia, ale nie ma ich u Hydra. Biorąc pod uwagę dużą różnorodność ancestralną genów Wnt, zaproponowano, że sygnalizacja Wnt kontrolowała rozwój planu budowy ciała u wczesnych metazoanów. Nemopilema posiada 13 ortologów Wnt reprezentujących 10 podrodzin Wnt (plik dodatkowy 1: Figura S22; Tabela S42). Wnt9 jest nieobecny u wszystkich cnidariow, co prawdopodobnie oznacza straty u wspólnego przodka cnidariow. U knidriów doszło do dynamicznej duplikacji podrodzin Wnt, takich jak Wnt8 (Nematostella, Acropora i Aurelia), Wnt10 (Hydra), Wnt11 i Wnt16 (Nemopilema i Aurelia). Zaproponowano, że wspólny klaster genów Wnt (Wnt1-Wnt6-Wnt10) istniał u ostatniego wspólnego przodka stawonogów i deuterostomów. Przeprowadzone przez nas analizy genomów cnidarian i bilaterii wykazały, że Acropora również posiada ten klaster, podczas gdy Nemopilema, Aurelia i Hydra nie mają Wnt6, co sugeruje utratę genu Wnt6 u wspólnego przodka Medusozoa (plik dodatkowy 1: rysunek S23). Podsumowując, meduzy mają porównywalną liczbę genów Hox i Wnt do innych cnidariów, ale dynamiczny repertuar tych rodzin genów sugeruje, że cnidaria ewoluowały niezależnie, aby dostosować swoje cechy fizjologiczne i cykl życia.

Przejście od polipa do meduzy u meduz

Przejście od polipa do meduzy jest znaczące u meduz w porównaniu z innymi gromadami cnidariów. Aby zrozumieć genetyczne podstawy formowania się struktury meduzy u meduz, porównaliśmy regulację transkrypcji między knidariami i na różnych etapach rozwoju meduz (patrz plik dodatkowy 1: sekcje 7.1 i 7.2). Złożyliśmy transkrypty Sanderia, wykorzystując sześć połączonych próbek transkryptomów (plik dodatkowy 1: Tabela S43). Złożone transkrypty miały całkowitą długość 61 Mb i dały 58 290 izoform transkryptów i 43 541 unikalnych transkryptów, z N50 wynoszącym 2325 bp. Średnio 87% odczytów RNA zostało dopasowanych do zmontowanych transkryptów (plik dodatkowy 1: Tabela S44), co wskazuje, że montaż transkryptów reprezentował większość sekwencjonowanych odczytów. Co więcej, skład domen białkowych zawartych w 20 najwyższych rangach był dość podobny pomiędzy Nemopilema i Sanderia (plik dodatkowy 1: Tabela S45). Aby uzyskać różnie wyrażone geny dla każdego stadium, porównaliśmy każde stadium z poprzednim lub następnym stadium w cyklu życiowym meduzy. W stadium polipa, które reprezentuje etap bezosłonowy w cyklu życiowym meduzy, wykazano wzbogacenie terminów związanych z aktywnością kanałów jonowych i metabolizmem energii (regulacja procesu metabolicznego i proces metabolizmu aminocukrów; plik dodatkowy 1: Tabela S46). Aktywne odżywianie się w polipie stymuluje bezpłciowe rozmnażanie się albo w kolejne polipy, albo metamorfozę w strobilę. Ponieważ antozoany nie tworzą meduzy, bezpłciowe stadium rozrodcze strobili jest ważnym etapem, w którym można badać metamorfozę z polipa do meduzy. W tym stadium, terminy GO związane z biosyntezą amidów i procesem metabolicznym ulegały wysokiej ekspresji w porównaniu do stadium polipa (plik dodatkowy 1: Tabela S47). Według doniesień, neuropeptydy RF-amid i LW-amid były związane z metamorfozą u knidriów. Jednak nie mogliśmy potwierdzić tego odkrycia w naszych porównaniach stadiów strobila i ephyra. W naszym systemie wzory ekspresji genów w obu stadiach są dość podobne. W ephyra, uwolnionym stadium ruchliwym, terminy GO obejmujące biosyntezę amidów i proces metaboliczny były również wysoko wyrażone w porównaniu do połączonego stadium meduzy (plik dodatkowy 1: Tabela S48). W meduzie, macierz pozakomórkowa, aktywność metalopeptydaz i procesy układu odpornościowego były wzbogacone (Dodatkowy plik 1: Tabela S49), zgodnie z fizjologią tkanek dzwonka, macek i ramion ustnych.

Metamorfoza z polipa do meduzy została wcześniej wykazana jako silnie związana z CL390 i genami receptora retinoidu X (RXR) u meduzy Aurelia aurita. Co ciekawe, CL390 nie został odnaleziony u Nemopilema ani innych opublikowanych knidriowate, co sugeruje, że może to być gen indukujący strobilizację specyficzny dla Aurelia. Potwierdzamy jednak, że RXR jest obecny u Nemopilema, a nieobecny u knidriów bez stadium meduzy (plik dodatkowy 1: Figura S24). Sygnalizacja kwasu retinowego (RA) odgrywa centralną rolę podczas wzrostu i rozwoju kręgowców, gdzie reguluje transkrypcję poprzez interakcję z receptorem RA (RAR) związanym z elementami odpowiedzi RA (RAREs) pobliskich genów docelowych . Spośród genów w szlaku sygnałowym RA, Nemopilema posiada enzymy ADH i RALDH, które metabolizują retinol do RA, oraz RXR i RAREs, które aktywują transkrypcję docelowego genu (ryc. 4a). Odkryliśmy 1630 regionów RARE Nemopilema o średniej odległości 13 Kbp do najbliższego genu (ryc. 4b; plik dodatkowy 1: tabele S50 i S51). Co ciekawe, cztery tylne geny Hox z Nemopilema i dwa geny Hox z Aurelia znajdowały się w odległości ± 10 Kbp od RARE, co jest unikalne wśród niebiałkowych metazoanów (ryc. 4c; plik dodatkowy 1: tabela S52). Łącznie, wyniki te sugerują, że sygnalizacja kwasu retinowego była obecna we wczesnych metazoanach do regulacji genów docelowych za pomocą RXR i RARE oraz że RXR i RARE mogą odgrywać krytyczną rolę w metamorfozie polipa do meduzy.

Identyfikacja domen związanych z toksynami u meduz

Meduzy wytwarzają złożone mieszaniny białkowych jadów do aktywnego chwytania ofiar i obrony. Zidentyfikowaliśmy obfite domeny toksyn u Nemopilema w porównaniu z zestawami genów niebiałkowych metazoanów w bazie danych Tox-Prot. W sumie, 67 z 136 domen toksyn dopasowało się do metazoanów niebilateralnych; z tych 67 domen toksyn, 52 znaleziono w Nemopilema (Dodatkowy plik 1: Tabela S53). Zgodnie z oczekiwaniami, genom Nemopilema zawiera największą liczbę domen związanych z jadem lub toksynami spośród wszystkich niebilateralnych metazoanów. Domeny te obejmują domeny metaloproteazy cynkowej z rodziny Reprolysin (M12B) (PF01421), fosfolipazy A2 (PF05826) i Prokinetyny (PF06607) (ryc. 5). Również Nemopilema i Aurelia posiadają odpowiednio 8 i 11 domen ShK-podobnych (PF01549), które są najliczniej występującymi domenami u tych gatunków w porównaniu z innymi niebilateriami. W szczególności, metaloproteazy cynkowe z rodziny Reprolysin (M12B) są enzymami rozszczepiającymi peptydy i obejmują większość endopeptydaz jadu węża. Ponadto stwierdzono, że inhibitor proteaz serynowych i domeny ShK obficie występowały w transkryptomach zarówno meduzy armatniej (Stomolophus meleagris), jak i meduzy pudełkowej (Chironex fleckeri), a fosfolipaza A2 jest dobrze scharakteryzowanym enzymem związanym z toksynami, który jest krytyczny dla produkcji składników jadu, występującym w klasie Scyphozoa.

.