Lejszmanioza psów (CanL) jest pierwotniakową infekcją/chorobą wywoływaną przez Leishmania infantum (synonimy: Leishmania chagasi; Leishmania infantum chagasi) wysoce rozpowszechnioną we wszystkich krajach śródziemnomorskich, kaukaskich i bliskowschodnich regionów Starego Świata, jak również na kilku terytoriach Ameryki Łacińskiej (Dantas-Torres i in., 2012). Wyniki zarażenia u psów wahają się od subklinicznych do klinicznych oraz od łagodnego do ciężkiego przebiegu choroby. Chociaż pasożyt może być czasami przenoszony w sposób niewektorowy (EFSA Panel on Animal Health and Welfare, 2015), główną drogą zarażenia jest ugryzienie przez zarażone ćmiankowate muchy piaskowe. Od około 7 dni po zakażonym posiłku z krwią, u kompetentnych wektorów w jelicie przednim mogą rozwijać się zakaźne promastigoty Leishmania, które są cofane do skóry ssaka żywiciela podczas kolejnego posiłku z krwią (Bates, 2007). Zarówno psy w stanie subklinicznym, jak i chore mogą być zakaźne dla wektorów; jednakże prawdopodobieństwo nieproporcjonalnego udziału w dalszej transmisji (efekt „super-spreadera”) wzrasta wraz z czasem trwania i nasileniem CanL (Courtenay i in., 2014).

Phlebotomus perniciosus jest głównym kompetentnym wektorem L. infantum w całym zachodnim basenie Morza Śródziemnego, w tym w południowej Europie i północno-zachodniej Afryce (Europejskie Centrum Zapobiegania i Kontroli Chorób, 2019). Ponadto P. perniciosus jest reprezentatywnym członkiem większej grupy taksonomicznej, podrodzaju Larroussius, składającego się z morfologicznie, genetycznie i biologicznie blisko spokrewnionych gatunków działających jako kompetentne wektory L. infantum w środkowej i wschodniej części basenu Morza Śródziemnego, takich jak Phlebotomus neglectus i Phlebotomus tobbi (Alten i in., 2016). Stosowanie miejscowych pyretroidów jest powszechnie uważane za metodę pierwszego rzutu w ochronie zdrowych psów przed ukąszeniami muchówek piaskowych zarażonych Leishmania (Maroli i in., 2010), podczas gdy postępowanie z psami zarażonymi/zakażonymi jest zadaniem złożonym ze względu na brak szerokiego konsensusu w odniesieniu do podejścia, jakie należy przyjąć. W idealnym przypadku, indywidualna opieka weterynaryjna w zakresie leczenia patologii CanL powinna być połączona z działaniami mającymi na celu zapobieganie rozprzestrzenianiu się pasożyta za pośrednictwem wektora. To ostatnie jest szczególnie ważne w ramach programów zwalczania zoonotycznych postaci VL, które są obecnie realizowane w wielu krajach endemicznych. Z jednej strony, właściciele niechętnie inwestują w produkty pyretroidowe dla psów już zarażonych lub chorych; z drugiej strony, terapie antyleishmanialne mają tylko tymczasową skuteczność, aby konsekwentnie zmniejszyć zakaźność psa dla much piaskowych (Miró i in., 2017). Izoksazoliny to nowatorska klasa związków ukierunkowanych na ośrodkowy układ nerwowy i złącza nerwowo-mięśniowe wektorów stawonogów poprzez blokowanie kanałów chlorkowych bramkowanych ligandami, powodując w ten sposób śmierć stawonoga (Weber & Selzer, 2016). Szereg związków zostało licencjonowanych jako leki weterynaryjne do ochrony zwierząt towarzyszących przed pchłami i kleszczami, z długimi okresami półtrwania in vivo, które zapewniają tygodnie do miesięcy ochrony po jednorazowym podaniu doustnym (Kilp i in., 2014; Shoop i in., 2014). Te właściwości przyciągnęły uwagę na potencjalne zastosowanie izoksazolin do kontroli chorób przenoszonych przez wektory u ludzi (Miglianico et al., 2018). W odniesieniu do owadów latających stwierdzono, że zarówno stopień, jak i czas trwania skuteczności owadobójczej różniły się wśród komercyjnie dostępnych leków izoksazolinowych podczas podawania u psów, np. przeciwko Triatoma infestans (Loza i in., 2017) lub muszce piaskowej Phlebotomus papatasi (Gomez i in., 2018a), przy czym fluralaner (Bravecto®; Merck Animal Health) okazał się najbardziej aktywnym związkiem w odniesieniu do powyższych parametrów skuteczności. Ostatnio w badaniu klinicznym leczenia fluralanerem psów przeciwko muszkom piaskowym wykorzystano skolonizowane P. papatasi jako gatunek docelowy (Gomez i in., 2018b). Jednak gatunek ten może nie być uważany za odpowiedni model muchy piaskowej. Wynika to przede wszystkim z faktu, że P. papatasi nie jest kompetentnym wektorem L. infantum, będąc opornym na rozwój jelitowy tego pasożyta. Ponadto, wcześniejsze badania nad pyretroidami stosowanymi miejscowo u psów (Maroli et al., 2010) sugerują, że P. papatasi może być mniej podatny na związki działające na centralny układ nerwowy muchy piaskowej niż P. perniciosus. Na przykład, preparat spot-on zawierający 50% permetryny-10% imidaklopridu zabił 29% P. papatasi w porównaniu do 49% P. perniciosus. Te rozważania skłoniły nas do określenia początku i czasu trwania skuteczności owadobójczej przeciwko P. perniciosus po karmieniu psów, którym podawano fluralaner.

Przeprowadzono równoległe, negatywnie kontrolowane, randomizowane, zaślepione, jednoośrodkowe badanie skuteczności. Psy doświadczalne, składające się z samców rasy Beagles w wieku ≥ 6 miesięcy w momencie włączenia do badania, pochodziły z kolonii badawczej w Mohammedia w Maroku; badanie fazy in-life przeprowadzono w ośrodkach Clinvet. Dorosłe osobniki P. perniciosus pochodziły z hiszpańskiego szczepu utrzymywanego od czerwca 2012 r. w pomieszczeniach entomologii medycznej Istituto Superiore di Sanità, Włochy, w temperaturze 28 ± 1 °C i wilgotności względnej 75-80%. Muchy piaskowe otrzymały certyfikat statusu wolnego od patogenów i zostały zaadaptowane do warunków masowej hodowli z sześcioma niezależnymi subliniami kolonii. Trzy- do 9-dniowe osobniki zostały zebrane z odpowiednich klatek i rozmieszczone w podobnych proporcjach wiekowych w cylindrycznych plastikowych doniczkach (400 mL) wyposażonych w szczelną pokrywę, która była perforowana, a otwór przykryty cienką gazą z kawałkiem bawełny nasączonej roztworem nasyconym glukozą. Liczba muszek piaskowych w każdej doniczce była wystarczająca dla jednego psa, z dodatkiem kilku dodatkowych osobników, aby zrekompensować zgony, które nastąpiły przed eksperymentami. Doniczki umieszczono w szczelnych plastikowych torebkach, wyposażonych w nawilżaną bibułę filtracyjną. Opakowanie wtórne składało się ze wstępnie ogrzanego pojemnika wyposażonego w urządzenie do stabilizacji temperatury i cyfrowy rejestrator temperatury, otoczonego mocnym kartonem. Pudełka zostały wysłane do Maroka drogą lotniczą, a dostawa nastąpiła w ciągu około 3 dni od wysyłki. Po dostawie sprawdzono zapis temperatury, a plastikowe torby pozostawiono nieotwarte w temperaturze 25 ± 3 °C w oczekiwaniu na ekspozycję psów. Dokonano wstępnej oceny śmiertelności much piaskowych w doniczkach z zewnątrz, a wskaźnik śmiertelności wynoszący ≤ 10% na doniczkę uznano za dopuszczalny do stosowania. Ostatecznie, w czasie przeprowadzania doświadczeń, każdy pies był narażony na działanie tej samej jednorodnej populacji much piaskowych starzejących się od 7 do 14 dni.

Dwadzieścia siedem dni przed leczeniem, 14 psów rasy Beagle było uspokojonych Domitorem® (Vetoquinol, Lure, Francja), a ich głowy były wystawione przez 1 godzinę na ugryzienia około 40 trzymanych w klatkach samic P. perniciosus, wraz z pięcioma samcami w celu promowania zachowań gryzących, co miało na celu ocenę indywidualnej atrakcyjności dla wektora w tych warunkach eksperymentalnych. Psy zostały uszeregowane w porządku malejącym na podstawie liczby żywych osobników; dwa psy z najniższą liczbą osobników zostały wykluczone z badania, a dwanaście psów zostało włączonych do badania i przydzielonych do dwóch grup po sześć psów każda (Grupa 1 i 2). W dniu 0, psy z Grupy 2 otrzymały doustną dawkę fluralaneru (Bravecto® tabletki do żucia) w dawce 25 do 56 mg/kg masy ciała, podczas gdy psy z Grupy 1 nie były leczone. Szczegółowe obserwacje stanu zdrowia przeprowadzono po 1, 2 i 6 godzinach od podania fluralaneru ostatniemu psu. Ekspozycję psów na około 40-60 samic P. perniciosus (plus 5-10 samców) przeprowadzono równolegle dla obu grup, w podobnych warunkach temperatury i wilgotności w dwóch pomieszczeniach, w dniach 1, 28 i 84 (początkowo rozważano przeprowadzenie oceny pośredniej w okresie około 50-60 dni po leczeniu, jednak nie było to możliwe ze względu na kwestie techniczne i logistyczne). Podstawowym kryterium dla określenia skuteczności był wskaźnik przeżywalności muszek piaskowych w pełni wykarmionych przez psy poddane działaniu preparatu w porównaniu z tymi w pełni wykarmionymi przez psy kontrolne, przy czym nie brano pod uwagę osobników częściowo lub w niewielkim stopniu wykarmionych krwią. W celu umożliwienia optymalnych i trwałych porównań pomiędzy dwiema grupami osobników muchy piaskowej, samice były pojedynczo wybierane z klatek ekspozycyjnych poprzez delikatne odsysanie z ust i łączone w grupy po ≤ 10 osobników w plastikowych doniczkach wyłożonych gipsem. Następnie doniczki umieszczono w skrzynkach wyposażonych w nasyconą glukozę i nawilżoną bibułę filtracyjną, po czym utrzymywano je w temperaturze 26 °C. Ocenę żywotności przeprowadzono po 6 godzinach (z wyjątkiem dnia 1), a następnie w odstępach 24-godzinnych do maksymalnie 96 godzin po zakończeniu ekspozycji. Aby ocenić ogólną żywotność partii muchy piaskowej stosowanej w każdym doświadczeniu, wyżej opisane procedury stosowano zarówno do karmionych, jak i niekarmionych samic.

Statystyczną istotność wyników skuteczności owadobójczej, wyrażonej jako proporcja żywych karmionych liczebników much piaskowych z Grupy 2 w stosunku do liczebników z Grupy 1, obliczono przy użyciu liniowego modelu mieszanego obejmującego grupę badaną jako efekt stały i blok randomizacji jako efekt losowy, z poziomem istotności ustalonym na α = 0,05 (dwustronnie). W modelu zastosowano dopasowanie Kenwarda-Rogersa w celu określenia stopni swobody mianownika.

W dniu 1, 78 próbek karmionych krwią z całkowitej liczby 159 żywych samic pobranych od psów z Grupy 2 zostało ocenionych w porównaniu do 64 próbek karmionych krwią/169 żywych samic od psów z Grupy 1. W 28. dniu życia oceniono 199/341 żywych samic z Grupy 2 w porównaniu do 146/310 z Grupy 1. W 84. dniu życia oceniono odpowiednio 240/326 żywych samic z Grupy 2 i 206/339 z Grupy 1. Tabela 1 przedstawia średnie proporcje przeżywających P. perniciosus po pobraniu posiłku z krwi u psów leczonych i nieleczonych. W 1. dniu od rozpoczęcia leczenia zaobserwowano kilka przypadków śmierci wśród zarobaczonych muchówek piaskowych już w czasie pobierania próbek z klatek Grupy 2, ale żaden z tych z Grupy 1. Do 24 h wszystkie osobniki karmione krwią z Grupy 2 były martwe, w przeciwieństwie do 11% osobników karmionych krwią z Grupy 1. W dniu 28, przeżywalność osobników karmionych przez psy z Grupy 2 była znacząco niższa niż osobników z Grupy 1 już w 6 h po posiłku; ponownie, wszystkie osobniki karmione krwią z Grupy 2 były martwe w 24 h, w przeciwieństwie do 3% osobników karmionych krwią z Grupy 1. W 84 dniu, pewna liczba osobników, które żywiły się psami poddanymi działaniu preparatu, przeżyła do końca obserwacji, z dużym zróżnicowaniem w grupach; ich przeżywalność spadała począwszy od 24 h i była znacząco niższa od 48 h w porównaniu z osobnikami karmionymi psami kontrolnymi, z obliczoną aktywnością owadobójczą powyżej 50% do 96 h obserwacji.

Oceniono również wskaźniki przeżywalności niedokarmionych much piaskowych zebranych z klatek ekspozycyjnych do 96 h po ekspozycji każdego psa. Były one ogólnie podwyższone i wyższe w porównaniu z tymi u osobników karmionych krwią, wykazując pewne różnice pomiędzy poszczególnymi dniami ekspozycji psa, chociaż nie tak duże pomiędzy grupami doświadczalnymi w każdej ekspozycji. Może to odzwierciedlać różnice w śmiertelności pomiędzy poszczególnymi partiami, typowo występujące pomiędzy pokoleniami skolonizowanych muchówek piaskowych, a także być może różne warunki transportu. Spożycie krwi było jedyną zmienną związaną ze 100% śmiertelnością much piaskowych u psów, którym podawano fluralaner (ryc. 1).

Niniejsze badanie, chociaż nie porównuje różnych gatunków much piaskowych, dostarcza dalszych dowodów na to, że wrażliwość na produkty owadobójcze dla psów, ukierunkowane na centralny układ nerwowy much piaskowych, może być wyższa u P. perniciosus niż u P. papatasi. Stosując ten sam preparat fluralaner i dawki w badaniu obejmującym Beagle narażone na ten gatunek, Gomez i wsp. (2018b) odnotowali częściowe przeżycie karmionych krwią samic P. papatasi (rzędu 6-7%) już w 17-31 dniu po leczeniu, które wzrosło do około 25% w 45 dniu.

Istnieje > 5-dniowy okres opóźnienia, w którym mucha piaskowa staje się zakaźna po spożyciu zakażonego posiłku z krwi. W związku z tym, istnieje techniczne wyzwanie dla badań systemowych insektycydów na muszkach piaskowych w odniesieniu do utrzymania wysokiej i trwałej przeżywalności karmionych krwią osobników kontrolnych i wykrywania wszelkich opóźnionych efektów owadobójczych, które nadal mają potencjał blokowania transmisji. Wyzwanie to różni się od większości badań z zastosowaniem preparatów zapobiegających karmieniu, w których muchy piaskowe są zabijane przez operatorów natychmiast po ekspozycji psa i oceniane jako karmione krwią/nie karmione. Potrzebne są długoterminowe oceny w celu zapewnienia sensownej interpretacji i statystycznej istotności różnic w przeżywalności pomiędzy grupami leczonymi i kontrolnymi (np. w czasie zstępującej fazy stężenia leków w osoczu psów). Wykorzystanie krwi ex vivo psów zarówno leczonych, jak i kontrolnych w systemach sztucznego karmienia może być podatne na zanieczyszczenia bakteryjne, a zatem skutkować szybką śmiercią wszelkich zarośniętych muszek piaskowych, umożliwiając w ten sposób tylko wąskie okno czasowe do rozróżnienia między aktywnymi i nieaktywnymi lekami (Gomez i in., 2018a). W niniejszym badaniu, przeżywalność osobników kontrolnych karmionych krwią była bardzo zadowalająca, z zakresem 61-81% w 96 h po posiłku z krwi.

Farmakokinetyka fluralaneru w osoczu psów po jednorazowym podaniu doustnym wykazywała regularny trend malejący aż do około 100 dni po leczeniu, kiedy to staje się niewykrywalna (Kilp i in., 2014). Interesujące jest to, że teoretyczny średni zakres około 40-100 ng fluralaneru/mL osocza, odpowiadający 84 dniom po leczeniu, nadal był w stanie zabić > 50% P. perniciosus w ciągu 48 h po posiłku z krwi. Dlatego pośrednie stężenia w osoczu, takie jak spodziewane między 28 a 84 dniem po leczeniu, prawdopodobnie również zapewniają podwyższoną aktywność owadobójczą wobec nosiciela, dlatego potrzebne są nowe badania, aby to potwierdzić. Z drugiej strony, wyniki obecnego badania w odniesieniu do trzech punktów czasowych wyraźnie wskazują na spójny trend zmniejszania skuteczności w trakcie całego badania.

W podsumowaniu, leczenie psów fluralanerem stanowi obiecującą metodę zmniejszenia puli zakażonych wektorów w endemicznych środowiskach zoonotycznej VL. Ponadto, stosowanie fluralaneru w połączeniu z profilaktycznym leczeniem miejscowym pyretroidami, pod warunkiem, że nie jest to przeciwwskazane dla bezpieczeństwa psa (Walther i in., 2014), może przynieść korzyści dla psów w obszarach wysokiego ryzyka.