RAPORT PRZYPADKU

U 5-letniego chłopca rozpoznano ostrą białaczkę limfoblastyczną w grudniu 1994 roku i włączono do protokołu Fralle 93. Dziecko osiągnęło remisję hematologiczną 6 tygodni po rozpoczęciu chemioterapii indukcyjnej. W kolejnych latach był obserwowany jako pacjent ambulatoryjny i dobrze reagował na leczenie. Jednak podczas konsultacji w marcu 1997 roku u pacjenta wystąpił epizod gorączkowy podczas perfuzji przy użyciu systemu Port-a-cath. Badanie kliniczne nie wykazało lokalizacji septycznej. Liczba leukocytów wynosiła 10 860/ml, a bezwzględna liczba neutrofilów 8 850/ml. Pobrano jeden zestaw posiewów krwi z Port-a-cath, a w tlenowej hodowli butelkowej uzyskano żółto-pigmentowane kolonie gram-dodatnich prątków korynkowych. Chłopiec otrzymał ceftriakson (1 g) dożylnie jeden raz, a następnie cefadroksyl w dawce 500 mg dwa razy dziennie przez 7 dni. Z powodu utrzymującej się gorączki cefadroksyl podawano jeszcze przez tydzień, a w tym czasie odstawiono leki immunosupresyjne. Przez kolejne 2 miesiące wywiad był bez zmian, a podczas comiesięcznych wizyt nie wykonywano posiewów krwi. W czerwcu 1997 roku dziecko zostało zgłoszone do konsultacji z powodu stanu podgorączkowego i skargi na zmęczenie. Badanie przedmiotowe nie wykazało ognisk zakażenia, a liczba leukocytów nie była podwyższona. Pobrano jeden zestaw posiewów krwi z cewnika Port-a-cath, a w fiolce z tlenem wykryto te same gram-dodatnie prątki korynckie, zidentyfikowane następnie jako Microbacterium sp. Rozpoznano bakteriemię związaną z cewnikiem i usunięto centralny cewnik żylny. W okresie okołooperacyjnym podawano dożylnie ampicylinę (100 mg/kg/dobę), a pierwszą dawkę podano 24 godziny przed zabiegiem. Stan kliniczny chorego uległ następnie szybkiej poprawie. Port-a-cath został wyhodowany na agarze z krwią Columbia. W ciągu 24 godzin w temperaturze 37°C wyhodowano czystą kulturę żółto-pigmentowanych kolonii niefermentującego, gram-dodatniego, nieco przebarwionego prątka. Niestety, podhodowle zostały utracone i nie można było przeprowadzić dalszych badań.

Szczep wyizolowany z hodowli krwi pacjenta, oznaczony jako CF36, był żółto pigmentowaną, ruchliwą koryneformą z metabolizmem oksydacyjnym, aktywnością proteolityczną i komórkowymi kwasami tłuszczowymi typu rozgałęzionego. Te ogólne cechy sugerują rodzaj Microbacterium, który obejmuje zarówno gatunki fermentacyjne jak i oksydacyjne, te ostatnie dawniej nazywane Aureobacterium (13).

Sekwencja genu 16S rRNA (rDNA) była badana przy użyciu jednego zestawu starterów do amplifikacji. Produkty PCR oczyszczano z żelu agarozowego za pomocą zestawu do ekstrakcji z żelu QIAquick (Qiagen, Westburg, Holandia). Analizę sekwencji przeprowadzono na automatycznym sekwenatorze DNA 3100 (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Foster City, Calif.) przy użyciu zestawu ABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit. Każda sekwencja została porównana z danymi sekwencyjnymi dostępnymi w bazach danych przy użyciu metody BLAST (10). Drzewo filogenetyczne skonstruowano metodą sąsiedztwa-łączenia (8, 11).

Sekwencjonowanie 16S rDNA na podstawie 1490 nukleotydów szczepu CF36 wykazało najwyższy poziom podobieństwa 99,5% z sekwencją M. luteolum DSM 20143T i 99,3% z sekwencją M. oxydans DSM 20578T. Był on również blisko spokrewniony z sekwencjami M. saperdae (99,2%) i M. liquefaciens (99,1%) (Tabela (Tabela1).1). Cztery inne podobne szczepy zostały pobrane z różnych próbek od innych pacjentów, które oznaczono jako CF7 wyizolowany z jednej hodowli krwi, CF34 z aspiratu oskrzelowego, CF130 z jednej hodowli krwi i CF40 z nieznanego źródła ludzkiego. Jeden dodatkowy szczep, CF128, uzyskano z próbki warzyw. Pięć szczepów wykazało sekwencje 16S rDNA podobne do sekwencji szczepu typu M. oxydans, w zakresie od 99,3 do 99,4% podobieństwa, podczas gdy ich stopień podobieństwa do CF36 wynosił od 99,9 do 100%. Dziewięć innych izolatów klinicznych wykazywało 99,9 do 100% podobieństwa do szczepu typu M. oxydans.

Wyniki te skłoniły nas do przeprowadzenia obszernych badań następujących sześciu szczepów: CF36, CF7, CF34, CF40, CF128, i CF130.

Komórkowe kwasy tłuszczowe, oznaczone w sposób opisany wcześniej (14), wykazywały ten sam profil u wszystkich szczepów. Średnie udziały procentowe głównych komórkowych kwasów tłuszczowych były następujące: 40,3% anteiso-C15:0 (zakres, 37,1 do 46,0%), 27% anteiso-C17:0 (zakres, 22,9 do 31,3%), 15,7% iso-C16:0 (zakres, 13,8 do 19,3%), 9,3% iso-C15:0 (zakres, 4,6 do 13,9%), i 4,2% iso-C17:0 (zakres, 3,0 do 7,2%).

Analiza peptydoglikanu ściany komórkowej CF36 i CF7 została przeprowadzona w Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ; Braunschweig, Niemcy) przez N. Weissa przy użyciu metody chromatografii cienkowarstwowej, jak opisali Schleifer i Kandler (12). Peptydoglikan był typu B2β z d-ornityną jako diaminokwasem.

Hybrydyzacja DNA-DNA została przeprowadzona przez P. Schumanna w DSMZ zgodnie z opisem De Ley et al. (3) z modyfikacjami Escara i Hutton (4) oraz Huss et al. (7). Stopień homologii DNA CF36 z M. luteolum LMG 16207T wynosił tylko 33,7%, a z M. oxydans DSM 20578T 46,6%, ale wysokie poziomy pokrewieństwa DNA wynoszące 78,1, 81,8 i 78,2% uzyskano odpowiednio ze szczepami CF7, CF34 i CF40. Było to zgodne z przyporządkowaniem ich do jednego gatunku. Zawartość G+C w DNA szczepu CF36 wynosiła 69,9 mol%, jak określono w DSMZ.

Sześć szczepów było gram-dodatnimi, ruchliwymi, coryneformalnymi prątkami. Dobrze rosły na agarze z krwią Columbia w temperaturze 37°C, a kolor kolonii był żółty. Szczepy były ściśle tlenowe, katalazo-dodatnie i oksydazo-dodatnie. Potrafiły hydrolizować eskulinę i żelatynę. Chociaż sekwencjonowanie 16S rDNA wykazało bliskie pokrewieństwo z M. luteolum, M. saperdae i M. liquefaciens, gatunki te różniły się fenotypowo. Żaden z nich nie rósł w temperaturze 37°C, M. luteolum i M. liquefaciens nie były ruchliwe, a M. luteolum i M. saperdae były nieproteolityczne. Wyniki te są zgodne z danymi zawartymi w literaturze (2). Właściwości fenotypowe szczepów były najbardziej zbliżone do właściwości M. oxydans. Glukozę zakwaszano oksydacyjnie na niskopeptydowym agarze z czerwienią fenolową (15). Wszystkie szczepy rosły w temperaturze 40°C, podczas gdy żaden z izolatów M. oxydans nie był zdolny do wzrostu w tej temperaturze. Ponadto salicyna nie ulegała zakwaszeniu, w przeciwieństwie do M. oxydans. Nowe szczepy można było również odróżnić od M. oxydans za pomocą pasków asymilacyjnych API 50CH (bioMérieux). Laktoza była wykorzystywana, a 2-ketoglukonian nie, podczas gdy M. oxydans wykazywał odwrotne reakcje. Gdy zastosowano paski API ZYM (bioMérieux), negatywne reakcje dla lipazy estrowej (C8), α-chymotrypsyny i β-glukozydazy oddzieliły sześć szczepów od M. oxydans. Cechy fenotypowe różnicujące nowe szczepy od pokrewnych oksydatywnych, ruchliwych, proteolitycznych gatunków Microbacterium rosnących w temperaturze 37°C podano w Tabeli22.

Wrażliwość na antybiotyki badano na agarze Mueller-Hinton za pomocą pasków E-test (PDM, Solna, Szwecja). Zakresy MIC (mikrogramy na mililitr) były następujące: penicylina, od 1,5 do 2; ampicylina, od 1 do 1,5; cefotaksym, od 3 do 6; cefalotyna, od 16 do 24; cyprofloksacyna, od 1 do 1,5; gentamycyna, od 2 do 3; wankomycyna, od 3 do 4; klarytromycyna, <0,016.

Badania fenotypowe, chemotaksonomiczne i genetyczne sugerują, że sześć badanych szczepów należy do rodzaju Microbacterium, ale stanowi nowy gatunek, dla którego zaproponowano nazwę Microbacterium paraoxydans i który jest blisko spokrewniony z M. oxydans, M. saperdae, M. luteolum i M. liquefaciens (Rys. (Rys.11).).

Tylko nieliczne doniesienia dotyczą izolacji gatunków Microbacterium z materiału klinicznego. Większość z nich była początkowo przypisana do grupy CDC A-4 lub A-5, a nawet nowsze izolaty rzadko były identyfikowane na poziomie gatunku (1, 5, 6, 9). Tylko w nielicznych przypadkach izolat okazał się być czynnikiem sprawczym zakażenia. Funke i wsp. opisali przypadek endophthalmitis wywołanego przez Microbacterium, a na podstawie sekwencjonowania 16S rDNA uznano, że szczep należy do nieopisanego gatunku (6). W badaniu Microbacterium spp. występujących w próbkach klinicznych, kilka szczepów zostało zidentyfikowanych jako M. arborescens i M. imperiale, ale nie dokonano potwierdzenia genetycznego (5). Zgłaszano szpitalne ognisko bakteriemii wywołanej przez Microbacterium u pacjentów z chorobą nowotworową, ale nie zidentyfikowano organizmu sprawcy do poziomu gatunku. Centralny cewnik żylny był głównym czynnikiem ryzyka w tym badaniu (1). Ostatnio opisano dwa przypadki bakteriemii Microbacterium związanej z cewnikiem, zidentyfikowanej na podstawie sekwencjonowania 16S rDNA. Jeden izolat był w 99,4% spokrewniony z M. oxydans, a drugi w 98,7% z M. trichothecenolyticum, ale formalna identyfikacja na poziomie gatunku nie została osiągnięta (9).

Szczep CF36 wyizolowano z posiewów krwi chorego w odstępie kilku tygodni i chociaż drobnoustrój wyizolowany z usuniętego cewnika udało się zidentyfikować tylko częściowo, jest prawdopodobne, że powtarzająca się bakteriemia była związana z cewnikiem, co potwierdza, że cewniki wewnątrznaczyniowe stanowią czynnik ryzyka zakażenia tymi drobnoustrojami. Ich źródłem może być skóra pacjenta, ale ponieważ naturalnym środowiskiem życia mikrobakterii jest środowisko nieożywione, nie można wykluczyć, że zanieczyszczony płyn perfuzyjny zasiał cewnik pacjenta.

W ciągu ostatnich dziesięcioleci w naszym laboratorium zebraliśmy 30 izolatów Microbacterium pochodzenia ludzkiego. Wszystkie te szczepy zostały zidentyfikowane na podstawie zestawu cech fenotypowych i chemotaksonomicznych oraz sekwencjonowania 16S rDNA. Zdecydowanie najczęściej izolowanym gatunkiem był M. oxydans, stanowiący około jedną trzecią szczepów (9 z 30), następnie M. paraoxydans (5 szczepów); M. aurum i M. lacticum były reprezentowane przez 4 szczepy. Pozostałe osiem szczepów było rozproszonych w kilku gatunkach, z jednym izolatem M. foliorum, jednym izolatem M. schleiferi, jednym izolatem M. testaceum i pięcioma izolatami, które nie pasowały do żadnego opisanego gatunku.

Chociaż mikrobakterie są rzadko zaangażowane w choroby ludzkie, liczba odpowiednich izolatów znajdowanych w warunkach szpitalnych wzrasta. Chociaż w obrębie rodzaju rozpoznano ponad 30 gatunków, prawdopodobnie tylko ograniczona liczba z nich jest izolowana z próbek klinicznych. Dokładniejsza identyfikacja ludzkich izolatów może pomóc nam lepiej zrozumieć, które gatunki są podatne na stanie się patogenami oportunistycznymi.

.