Powstanie medycyny „precyzyjnej” charakteryzuje się wieloma nowymi ulepszeniami w metodach i schematach diagnostycznych, prognostycznych i terapeutycznych. W ramach tej inicjatywy skupiono się na zminimalizowaniu ilości tkanki potrzebnej do badań za pomocą mniej inwazyjnych i bezpieczniejszych procedur. Jedną z metod, która w ostatnich latach wzbudziła duże zainteresowanie, jest „płynna biopsja”. Chociaż definicje tego terminu różnią się co do jego dokładnego znaczenia, można go ogólnie rozumieć jako pobranie próbki płynu ustrojowego w celu zbadania obecności odpowiednich biomarkerów, które mogą być wykorzystane w postępowaniu z pacjentem. Najczęściej stosuje się go do pobierania krwi obwodowej w celu analizy bezkomórkowych krążących nowotworowych kwasów dezoksyrybonukleinowych (DNA).
Pierwszy opis krążącego DNA wolnego od komórek w ludzkiej krwi pojawił się w 1948 roku, ale nie zwróciło to większej uwagi szerszej społeczności naukowej 2. W 1977 r. naukowcy zidentyfikowali obecność nienormalnie wysokich poziomów DNA bezkomórkowego (cfDNA) w osoczu i surowicy pacjentów chorych na raka w porównaniu z pacjentami zdrowymi, a to cfDNA zostało uznane za reprezentujące głównie krążące DNA nowotworowe (ctDNA)1,5. Od czasu tego pierwotnego opisu, inne badania wykazały, że zwiększona ilość cfDNA odzwierciedla wiele procesów patologicznych, w tym złośliwe i łagodne stany nowotworowe, choroby zapalne, udar, uraz i sepsę. Podczas tych procesów kwasy nukleinowe mogą być uwalniane do krwi przez komórki apoptotyczne i martwicze lub przez kontrolowane wydzielanie przez żywe komórki2,11. Podczas gdy DNA bezkomórkowe jest często używane jako synonim krążącego DNA guza, należy pamiętać, że krążące nienowotworowe i nie-ludzkie DNA może być również obecne w próbce.
Podczas gdy obecny nacisk kładziony jest głównie na DNA, dodatkowe składniki płynnej biopsji obejmują kwasy rybonukleinowe (RNA), krążące komórki nowotworowe (CTCs), pęcherzyki pozakomórkowe (EVs) i płytki krwi wykształcone przez nowotwór (TEPs). Te ostatnie elementy są głównie przedmiotem zainteresowania badawczego. Ponieważ prowadzi się więcej badań translacyjnych, te dodatkowe składniki płynnej biopsji mogą mieć w przyszłości coraz większe zastosowanie kliniczne. Przegląd tych elementów wykracza poza zakres niniejszego artykułu, a czytelnik jest odsyłany do artykułu Battha i wsp. w celu dalszej lektury.
Uwagi technologiczne
Do niedawna dostępna technologia nie była wystarczająco czuła, aby wykryć ctDNA i wykorzystać je w znaczący sposób. W przeciwieństwie do badań molekularnych wykonywanych na płynach ustrojowych w celu wykrycia kwasów nukleinowych pochodzących z wirusów i innych mikroorganizmów, które wykorzystują stosunkowo duże ilości kwasów nukleinowych, krążące fragmenty kwasów nukleinowych guza występują w ułamku normalnego cfDNA niebędącego nowotworem. ctDNA to zwykle małe fragmenty DNA w zakresie 140-170 par zasad (bp)3, a typ guza, progresja, obciążenie, tempo proliferacji i terapia wpływają na ilość ctDNA w próbce. Ponadto, chociaż ctDNA jest stosunkowo stabilne w osoczu i surowicy, jest usuwane z krążenia przez wątrobę i nerki w ciągu kilku godzin 3,4. Niemniej jednak postęp w procesach przedanalitycznych i metodach oczyszczania umożliwił skuteczne wychwytywanie, amplifikację i sekwencjonowanie ctDNA.
Metody, które są obecnie stosowane do wykrywania lub pomiaru ctDNA, można ogólnie podzielić na dwie kategorie: oparte na łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) i oparte na sekwencjonowaniu następnej generacji (NGS). Oznaczenia oparte na PCR mają zazwyczaj szybszy czas realizacji i są mniej kosztowne, ale zazwyczaj mogą oceniać tylko jedną lub kilka określonych mutacji jednocześnie (ograniczona zdolność multipleksowania). Metody oparte na PCR mogą być dalej podzielone na metody, które wzbogacają zmutowane sekwencje w stosunku do typu dzikiego (niezmutowane) oraz te, które osiągają kwantyfikację przez kompartmentalizację. Przykładem tej ostatniej grupy jest „cyfrowy PCR”, który staje się szeroko stosowany do wykrywania oraz kwantyfikacji specyficznych, znanych mutacji w ctDNA. PCR jest podzielony na tysiące maleńkich indywidualnych objętości reakcyjnych, albo na chipie, albo poprzez tworzenie kropelek typu woda w oleju. Każda komora lub kropla albo zawiera docelowy fragment szablonu albo nie i wytwarza sygnał fluorescencyjny, jeśli odpowiedni fragment szablonu jest obecny w tej objętości. Licząc poszczególne objętości fluorescencyjne, możliwe jest oszacowanie liczby specyficznie ukierunkowanych cząsteczek szablonu w próbce. Dla wielu celów badanych jednocześnie (multipleksowanie), różne sygnały fluorescencyjne mogą być przypisane do specyficznych sekwencji wariantów.
Podejścia oparte na sekwencjonowaniu następnej generacji pozwalają na ocenę znacznie szerszego zakresu możliwych mutacji, ponieważ sekwencjonowanie może wykryć mutacje występujące wszędzie w obrębie wychwyconych regionów. Aby wycelować w podatne na mutacje regiony genomu, biblioteki NGS mogą być przygotowane z DNA osocza przy użyciu metod wychwytu ligacyjnego/hybrydowego lub metod ukierunkowanego wzbogacania PCR. Frakcje alleli wariantowych są zwykle znacznie niższe w płynnych biopsjach niż w biopsjach tkankowych, często <1%, więc regiony zainteresowania muszą być sekwencjonowane głębiej niż w NGS pierwotnej tkanki nowotworowej. Ponadto, konieczna jest szeroko zakrojona optymalizacja procesów przedanalitycznych i analitycznych w celu maksymalizacji próbki wejściowej i redukcji błędów PCR i sekwencjonowania. Metody NGS mają tę ważną zaletę, że są w stanie osiągnąć znacznie szersze pokrycie mutacyjne (jednoczesna analiza tysięcy możliwych mutacji). Dzięki temu nie jest potrzebna wcześniejsza wiedza o specyficznych mutacjach guza. Jednakże, w porównaniu z prostszymi metodami opartymi na PCR, techniki NGS są droższe, bardziej czasochłonne i trudniejsze technicznie.
Wady i zalety
Zalety płynnych biopsji leżą głównie w znacznie mniej inwazyjnej naturze procedur ich uzyskiwania w stosunku do standardowych biopsji guza. Rozważmy, na przykład, proces związany z biopsją masy płuca. Jeśli masa znajduje się w miejscu dostępnym dla radiologii interwencyjnej lub biopsji chirurgicznej, istnieje ryzyko odmy opłucnowej lub krwotoku, niezależnie od kosztów utrzymania bloku operacyjnego, w którym można przeprowadzić operację. Płynne biopsje umożliwiają również częstsze i seryjne pobieranie próbek w czasie, co pozwala na lepsze poznanie zachowania guzów i ich odpowiedzi na terapię. Na przykład w jednym z badań pacjenci z rakiem jelita grubego, u których później radiograficznie wykazano dobrą odpowiedź na leczenie, mieli spadek poziomu ctDNA o >90% po pierwszych 2 tygodniach leczenia 9. Wykazano, że pozwala to stratyfikować ryzyko nawrotu po resekcji z intencją leczniczą. W innym badaniu pacjentki z rakiem piersi z wykrywalnym ctDNA po resekcji miały 25-krotnie wyższe ryzyko nawrotu 10. Koncepcje te są analogiczne do badań, które są obecnie wykonywane w przypadku nowotworów hematologicznych, takich jak przewlekła białaczka szpikowa (CML) i seryjne badania na obecność transkryptów fuzyjnych BCR-ABL. Wreszcie, w przypadkach, gdy biopsja tkanki nie jest dostępna, profilowanie molekularne guzów może być nadal wykonywane za pomocą płynnej biopsji.
Ważne wady płynnej biopsji obejmują potrzebę wstępnej diagnozy histologicznej, która musi być uzyskana przez biopsję tkanki. Laboratoria wykonujące te badania muszą pamiętać o odpowiednim wykorzystaniu testu i możliwości „nadinterpretacji” w kontekście klinicznym. Niska częstotliwość wariantów w obrębie krwi obwodowej może prowadzić do wyższych wskaźników fałszywie ujemnych i wymagać znacznie większych wysiłków technicznych i wiedzy specjalistycznej w celu uzyskania wiarygodnych wyników.
Obecne i powstające zastosowania
Kliniczne zastosowanie płynnej biopsji znacznie wzrosło od 2014 roku, kiedy to udostępniono pierwszą komercyjnie dostępną platformę płynnej biopsji wielogenowej. Kilka testów jest dostępnych komercyjnie i zatwierdzonych przez FDA, a niektóre są uznawane za wystarczające do kwalifikacji do leczenia przez firmy ubezpieczeniowe. Na przykład w 2016 roku FDA zatwierdziła test cobas® EGFR Mutation Test v2 w celu określenia kwalifikowalności pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca do otrzymania określonych inhibitorów kinazy tyrozynowej EGFR . Przyjęcie płynnej biopsji w celu wykluczenia pacjentów z terapii celowanej było znacznie wolniejsze, głównie ze względu na obawy dotyczące fałszywych wyników negatywnych i ogólnie dostępnej tkanki nowotworowej 3. Rosnące wykorzystanie kliniczne było również napędzane przez pacjentów i lekarzy pragnących zidentyfikować mutacje, które mogą być celem terapii, do zastosowania poza wskazaniami lub zapisania się do badań klinicznych.
Pojawiające się zastosowania płynnych biopsji obejmują ich wykorzystanie jako uzupełnienie profilowania mutacyjnego biopsji tkankowej, ocenę odpowiedzi na leczenie, monitorowanie choroby resztkowej, wykrywanie nawrotów choroby oraz monitorowanie pojawienia się mutacji oporności 3.
Przyszłe kierunki
Spodziewana specyficzność nowotworowa mutacji sprawia, że ctDNA jest atrakcyjnym biomarkerem do wczesnego wykrywania nowotworów, co może mieć ogromny wpływ na opiekę nad pacjentami. Jednakże, ponieważ wiadomo, że guzy we wczesnym stadium uwalniają bardzo mało DNA, istnieje wiele technicznych wyzwań, które należy przezwyciężyć. Chociaż biopsja płynna może być atrakcyjnym narzędziem do badań przesiewowych w kierunku raka u pacjentów bezobjawowych, takie zastosowania będą musiały być starannie i przemyślanie rozważone, aby uniknąć nadmiernego cierpienia pacjentów i kosztów spowodowanych fałszywymi wynikami dodatnimi. W perspektywie krótkoterminowej płynne biopsje mogą być bardziej pomocne w potwierdzaniu złośliwości u pacjentów z już widocznymi klinicznie lub radiograficznie zmianami.
Wnioski
Piśmiennictwo koncentrujące się na badaniach ctDNA szybko się rozszerza i ewoluuje. Trwające obszary badań obejmują procesy przedanalityczne, czynniki wpływające na szybkość wykrywania ctDNA oraz prospektywne badania kliniczne. Prawdopodobnie zobaczymy bardziej powszechną rolę ctDNA w opiece klinicznej, ponieważ dalsze badania nad CTCs, cfDNA/RNA i pęcherzykami pozakomórkowymi zapewnią większą rozdzielczość migawki stanu guza uzyskanej dzięki płynnym biopsjom 4.
.