Szczepy bakteryjne i warunki wzrostu

Szczepy bakteryjne są wymienione w Tabeli Dodatkowej 2. Escherichia coli hodowano na płytkach Luria Broth (LB) lub w płynnym podłożu LB, uzupełnionym 200 µg ml-1 erytromycyny, w temperaturze 37 °C. Transformację E. coli z plazmidowym DNA przeprowadzono przy użyciu komórek chemicznie kompetentnych. S. pneumoniae serotyp 2 D39 i serotyp 4 TIGR4 oraz ich izogeniczne mutanty hodowano na płytkach z podłożem Columbia blood agar (Oxoid) z dodatkiem erytromycyny (5 µg ml-1) i/lub chloramfenikolu (5 µg ml-1) lub w bulionie Todda-Hewitta z dodatkiem 0,5% ekstraktu drożdżowego (THY; Roth) albo w podłożu chemicznie zdefiniowanym (RPMImodi 26; GE Healthcare, Bio-Sciences). Hodowlę pneumokoków na agarze z krwią lub w hodowlach płynnych prowadzono w temperaturze 37 °C i 5% CO2 bez mieszania.

Budowa mutantów

Do budowy pneumokokowych mutantów tacL w D39 i TIGR4, fragment DNA składający się z S. pneumoniae D39 spd_1672 i jego górno- i dolno-strumieniowych regionów flankujących amplifikowano metodą PCR z genomowego DNA przy użyciu primerów SPD1672_OLup_for i SPD1672_OLdwn_rev (primery są wymienione w Tabeli 2). Oczyszczone produkty PCR klonowano do pUC18, a uzyskanym plazmidem transformowano chemicznie kompetentne komórki E. coli DH5α. Rekombinowany plazmid pNH1 zawierający pożądaną wstawkę DNA oczyszczono i użyto jako szablon do reakcji inverse PCR ze starterami InvrevKpnISPD1672 i InvforPstISPD1672. Usuniętą sekwencję genową zastąpiono genem ermB, amplifikowanym metodą PCR z wektora pTP1 przy użyciu primerów InvrevKpnIErm i InforPstIErm. Ostateczny zrekombinowany plazmid użyto do transformacji i mutagenezy pneumokoków. Wydajność transformacji oceniano stosując końcowy plazmid rekombinowany vs. inny plazmid delecyjny (do delecji genu cbpL) w S. pneumoniae D39Δcps 44. Co godne uwagi, wydajność transformacji została w ten sposób znacząco zwiększona dla delecji tacL (2,8 kolonii na ng plazmidu dla cbpL vs. 29,8 kolonii na ng plazmidu dla tacL).

Isogeniczne mutanty zostały uzupełnione przez system in trans oparty na pBAV1CpE; pBAV1CpE został zmodyfikowany z pBAV1K-T5-gfp45, poprzez wymianę genu oporności na kanamycynę na gen oporności na chloramfenikol oraz promotora T5 na region promotora erytromycyny (pE), który zawiera miejsce wiązania rybosomów i kodon startowy. Kompletny gen spd_1672 amplifikowano metodą PCR przy użyciu primerów 1672_com_for i Spd1672_com_rev, a oczyszczony fragment klonowano do pBAV1CpE. Otrzymany w ten sposób plazmid pBAV-tacL użyto do transformacji izogenicznych mutantów tacL. Delecję tacL oraz komplementację in trans zweryfikowano przy użyciu qRT-PCR (ryc. 3).

Real-time quantitative PCR (qRT-PCR)

Enkapsulowany i nieenkapsulowany szczep D39 typu dzikiego, mutanta z niedoborem tacL oraz mutanta komplementarnego hodowano w THY do fazy mid-log (A 600 = 0,35-0,45) i zbierano do izolacji RNA przy użyciu zestawu EURx GeneMatrix Universal RNA purification kit (roboklon). Jakość RNA sprawdzano za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym oraz standardowej reakcji PCR z użyciem primerów EnoRT_F i EnoRT_R (patrz Tabela 2). Syntezę cDNA przeprowadzono przy użyciu SuperScript III Reverse Transcriptase (ThermoFisher) i primerów heksamerycznych (GE Healthcare) zgodnie z instrukcjami producenta. Jakość cDNA kontrolowano metodą PCR z użyciem primerów EnoRT_F i EnoRT_R, a stężenie mierzono nanodropem. cDNA przechowywano w temperaturze -20 °C do czasu dalszych badań. Do eksperymentów qRT-PCR użyto StepOnePlusTM Real-Time PCR System (Applied Biosystems) i SYBR® Green Master Mix (Biorad) w połączeniu ze starterami specyficznymi dla tacL, jak również starterami enolazowymi jako kontrolą (patrz Tabela 2). Do analizy danych użyto oprogramowania StepOne (v. 2.3, Life Technologies). Ostateczne wyniki są przedstawione jako wielkość fluorescencji (ΔRn) wykreślona względem numerów cykli PCR.

Sekwencjonowanie i analiza bioinformatyczna

Sekwencjonowanie: 1 ng oczyszczonego chromosomalnego DNA z S. pneumoniae szczepów D39Δcps (PN111), D39ΔcpsΔtacL (PN601), D39ΔcpsΔtacL pBAV-tacL (PN634), TIGR4Δcps (PN259), TIGR4ΔcpsΔtacL (PN603), i TIGR4ΔcpsΔtacL pBAV-tacL (PN636) użyto do przygotowania indywidualnych bibliotek, stosując i postępując zgodnie z Illumina Nextera© XT DNA Library Prep Kit. Bioanalizator Agilent Technology 2100 służył do weryfikacji tagowania i ostatecznego rozkładu wielkości fragmentów biblioteki na wysokoczułym chipie DNA. Do oczyszczania biblioteki DNA zastosowano kulki AMPure XP. Ostatecznie połączoną bibliotekę nanoszono na zestaw MiSeq Reagent v3 600cycle i sekwencjonowano w systemie MiSeq w 300 cyklach w trybie paired-end. Końcowa pula bibliotek została spikowana 5% biblioteką kontrolną PhiX. Uzyskano gęstość klastrów 847 ± 25 (K mm-2), przy czym 96,46 ± 1,48% klastrów przeszło specyfikację filtrów. 20,3 mln odczytów (94,7%) z 21,1 mln całkowitych odczytów przeszło specyfikacje filtrów, co dało 12,52 Gbp danych sekwencyjnych. Odczyty indeksowe były równomiernie rozmieszczone w sześciu pojedynczych próbkach. Wygenerowane pliki FASTQ zostały poddane dalszej analizie bioinformatycznej, jak opisano poniżej.

Wykrywanie i anotacja SNP: Wykrywanie SNP przeprowadzono dla S. pneumoniae D39Δcps, D39ΔcpsΔtacL, TIGR4Δcps, TIGR4ΔcpsΔtacL indywidualnie przy użyciu „snippy” (https://github.com/tseemann/snippy; parametr: minimalna porcja dla dowodu wariantu: 60%; minimalne pokrycie miejsca wariantu: ≥5 sekwencji reads). Jako genomu referencyjnego użyto Streptococcus pneumoniae D39 (NC_008533.1) lub Streptococcus pneumoniae TIGR4 (NC_003028.3).

Wynikowe SNPs dla każdej grupy mutantów (D39Δcps vs. D39ΔcpsΔtacL) i (TIGR4Δcps vs. TIGR4ΔcpsΔtacL) zostały połączone i porównane. Pokrycie genomu oszacowano za pomocą qualimap46 przy użyciu tych samych genomów referencyjnych, co do wykrywania SNP.

Isolacja pneumokokowych kwasów teichoinowych

Ekstrakcja i izolacja LTA: Oczyszczanie LTA przeprowadzono zasadniczo tak, jak opisano w innym miejscu7, ale w celu optymalizacji wydajności pnLTA zmodyfikowano jeden szczegół. Komórki pneumokokowe zawieszano w buforze cytrynianowym (50 mM, pH 4,7) i trzykrotnie rozbijano za pomocą prasy francuskiej (Constant Cell Disruption System, nr seryjny 1020) w temperaturze 10 °C pod ciśnieniem 20 kPSI. Do połączonych supernatantów dodawano SDS o końcowym stężeniu 4%. Roztwór inkubowano przez 30 min w temp. 100 °C, a następnie mieszano przez noc w temperaturze pokojowej. Roztwór odwirowano przy 30 000×g przez 15 min w temp. 4 °C. Osad przepłukano czterokrotnie buforem cytrynianowym, stosując warunki wirowania jak wyżej. Połączone supernatanty zawierające LTA i powstały osad, zawierający surowy kompleks PGN-WTA, były liofilizowane oddzielnie. Powstałe ciała stałe przemywano pięciokrotnie etanolem (wirowanie: 20 min, 20 °C, 10,650×g) w celu usunięcia SDS i liofilizowano (uzyskując pelet A zawierający LTA i pelet B zawierający kompleks PGN-WTA). W celu izolacji LTA, osad A był ponownie zawieszony w buforze cytrynianowym i ekstrahowany równą objętością butan-1-olu (Merck) w temperaturze pokojowej pod energicznym mieszaniem. Fazy rozdzielono przez wirowanie przy 2,100×g przez 15 min w 4 °C. Zebrano fazę wodną (zawierającą LTA), a procedurę ekstrakcji powtórzono dwukrotnie z fazą organiczną i interfazą. Połączone fazy wodne liofilizowano, a następnie dializowano przez 5 dni w temperaturze 4 °C w 50 mM buforze octanu amonu (pH 4,7; membrana o odcięciu 3,5 kDa); bufor zmieniano co 24 h. Otrzymany surowy LTA oczyszczano dalej metodą chromatografii oddziaływań hydrofobowych (HIC) na kolumnie HiPrep Octyl-Sepharose (GE Healthcare; 16 × 100 mm, objętość złoża 20 ml). Surowy materiał LTA rozpuszczano w jak najmniejszej ilości buforu wyjściowego (15% propan-1-ol (Roth) w 0,1 M octanie amonu (pH 4,7)) i odwirowywano przy 13 000×g przez 5 min w temperaturze pokojowej, a uzyskany supernatant liofilizowano. Granulat zawierający LTA rozpuszczano w buforze startowym HIC w stężeniu 30 mg ml-1 i oczyszczano za pomocą HIC stosując gradient liniowy od 15 do 60% propan-1-olu (Roth) w 0,1 M octanie amonu (pH 4,7). Frakcje zawierające LTA zostały zidentyfikowane za pomocą fotometrycznego testu fosforanowego47. Frakcje zawierające fosforany zostały połączone, zliofilizowane i przemyte wodą po liofilizacji w celu usunięcia pozostałości buforu.

Ekstrakcja i izolacja WTA: Izolację i ekstrakcję WTA przeprowadzono zgodnie z opisem w innym miejscu11, ale z niewielkimi modyfikacjami. Pelet B (zawierający surowy kompleks PGN-WTA), który powstał podczas izolacji LTA, został ponownie zawieszony w stężeniu 10 mg ml-1 w 100 mM Tris-HCl (pH 7,5) zawierającym 20 mM MgSO4. Dodawano DNazę A i RNazę I w końcowych stężeniach odpowiednio 10 i 50 µg ml-1. Zawiesinę mieszano przez 2 h w temp. 37 °C. Następnie dodawano 10 mM CaCl2 oraz trypsynę (100 µg ml-1) i mieszanie kontynuowano przez noc w temperaturze 37 °C. Dodawano SDS o końcowym stężeniu 1%, a mieszaninę inkubowano przez 15 min w temp. 80 °C w celu inaktywacji enzymów. Ścianę komórkową odzyskiwano przez wirowanie przez 45 min przy 130,000×g w temp. 25 °C. Otrzymany osad zawieszano ponownie w 0,8 ml 8 M LiCl na 1 ml pierwotnie użytego roztworu Tris-HCl i inkubowano przez 15 min w temp. 37 °C. Po kolejnym odwirowaniu z zastosowaniem tych samych warunków jak powyżej, osad został ponownie zawieszony w 1 ml 10 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA, pH 7,0) na 1 ml pierwotnie użytego roztworu Tris-HCl, a próbka była inkubowana w temperaturze 37 °C przez 15 minut. Osad przepłukano dwukrotnie wodą. Na koniec zawieszono go w 2-4 ml wody i zliofilizowano, uzyskując oczyszczony kompleks PGN-WTA. W zależności od konkretnego pytania badawczego, wykonywano następnie dalszą obróbkę chemiczną lub enzymatyczną.

Obróbka chemiczna i enzymatyczna

Obróbka hydrazyną LTA: Oczyszczony LTA rozpuszczano w stężeniu 5 µg µl-1 w bezwodnej hydrazynie (N2H4; ICN Biomedicals) przed inkubacją przez 1 h w 37 °C, mieszając. Reakcję stłumiono przez dodanie takiej samej objętości acetonu i wysuszono pod strumieniem azotu; etap suszenia powtórzono dwukrotnie. Następnie surowy de-O-acylowany LTA oczyszczano metodą chromatografii żelowo-permeacyjnej (GPC) na kolumnie Bio-Gel P-10 (45-90 µm, BioRad; rozmiar kolumny: 1,5 × 120 cm; bufor: 150 mM octan amonu (pH 4,7)) column.

Enzymatyczne trawienie kompleksu PGN-WTA: Aby usunąć wszystkie aminokwasy z PGN, kompleks PGN-WTA rozpuszczono w 50 mM Tris-HCl (pH 7,0; 10 mg ml-1) i poddano działaniu pneumokokowej amidazy LytA, jak opisano w innym miejscu11. Rekombinowaną amidazę LytA znakowaną Hisem (10 µg LytA na mg) dodawano w trzech podwielokrotnościach po 0, 24 i 48 godzinach w celu uzyskania całkowitego okresu inkubacji wynoszącego 72 godziny w temperaturze 37 °C. Następnie enzym był inaktywowany przez gotowanie przez 5 min w 100 °C. Po odwirowaniu (25,000×g, 15 min, 20 °C), zebrano supernatant i zliofilizowano. Surowy kompleks PGN-WTA poddany działaniu LytA oczyszczano dalej metodą GPC na kolumnie Bio-Gel P-30 (45-90 µm, BioRad; rozmiar kolumny: 1,5 × 120 cm; bufor: 150 mM octan amonu (pH 4,7)). Otrzymany materiał o wysokiej masie cząsteczkowej (~12 mg) był dalej trawiony lizozymem (200 µg; Sigma) i mutanolizyną (200 µg; Sigma) w 800 µl mieszaniny reakcyjnej zawierającej fosforan sodu (20 mM; pH 4,8) i azydek sodu (0,02%) w temperaturze 37 °C przez noc. Enzymy zostały inaktywowane przez ogrzewanie w temperaturze 100 °C przez 5 minut. Materiał rozpuszczalny odzyskano przez odwirowanie (18,000×g, 10 min, 20 °C) i zliofilizowano. Izolację pnWTA związanego z małymi fragmentami PGN uzyskano przez końcowe GPC z zastosowaniem wyżej wymienionych warunków.

Spektroskopia NMR

Pomiary spektroskopowe NMR przeprowadzono w D2O w temperaturze 300 K na aparacie Bruker AvanceIII 700 MHz (wyposażonym w odwróconą 5 mm poczwórnie rezonansową krioprobe Z-grad). Deuterowane rozpuszczalniki zostały zakupione od Deutero GmbH (Kastellaun, Niemcy). Aceton był używany jako zewnętrzny wzorzec do kalibracji widm 1H (δH 2.225) i 13C (δC 30.89) NMR. Widma 31P NMR (δP 0.0) były kalibrowane 85% kwasem fosforowym w D2O jako zewnętrznym wzorcem. Przyporządkowanie 1H NMR zostało potwierdzone przez dwuwymiarowe eksperymenty 1H, 1H COSY i TOCSY, a przyporządkowanie 13C NMR zostało wskazane przez dwuwymiarowe eksperymenty 1H, 13C HSQC, w oparciu o przyporządkowanie 1H NMR. Łączność międzyszczątkowa i dalsze dowody na przyporządkowanie 13C zostały uzyskane z dwuwymiarowych eksperymentów 1H, 13C HMBC i 1H, 13C HSQC-TOCSY. Łączność grup fosforanowych została przypisana za pomocą dwuwymiarowych eksperymentów 1H, 31P HMQC i 1H, 31P HMQC-TOCSY. Wszystkie dane zostały uzyskane i przetworzone przy użyciu oprogramowania Bruker TOPSIN V 3.0 lub nowszego.

Spektrometria mas

Aby przeanalizować pnWTA związanego z małymi fragmentami PGN, wykonano spektrometrię mas z jonizacją elektrospray fourier-transform ion cyclotron resonance (ESI-FT-ICR-MS) na instrumencie 7 Tesla APEX Qe (Bruker Daltonics, Bremen, Niemcy) przy użyciu trybu jonów ujemnych i mieszaniny wody/propan-2-ol/7 M trietyloaminy/kwasu octowego (50:50:0.06:0.02 v/v/v/v) jako rozpuszczalnika, jak opisano wcześniej6. Analizę MS LTA poddanych działaniu hydrazyny przeprowadzono na urządzeniu Q Exactive Plus (Thermo Scientific, Bremen, Niemcy) w trybie jonów ujemnych przy użyciu tego samego rozpuszczalnika. Zastosowano źródło jonów Triversa Nanomate (Advion, Ithaca, USA) z napięciem rozpylania ustawionym na -1,1 kV. Skalę mas kalibrowano zewnętrznie za pomocą glikolipidów o znanej strukturze, a wszystkie widma poddawano dekonwolucji ładunku. Podane liczby masowe odnoszą się do mas monoizotopowych cząsteczek neutralnych.

Mikroskopia elektronowa

Skaningowa mikroskopia elektronowa z emisją polową: bakterie utrwalano w podłożu wzrostowym 5% formaldehydem i 2,5% glutaraldehydem przez 1 h na lodzie i przemywano buforem HEPES (HEPES 0,1 M, 0,09 M sacharozy, 10 mM CaCl2, 10 mM MgCl2, pH 6,9). Podwielokrotność 50 µl utrwalonego roztworu bakterii umieszczano na szkiełkach nakrywkowych pokrytych poli-l-lizyną i pozostawiano na 10 min do osadzenia. Po utrwaleniu 2% glutaraldehydem w PBS przez 5 min w temperaturze pokojowej, szkiełka nakrywkowe przemywano buforem TE (20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 6,9) przed odwodnieniem w stopniowanej serii acetonu (10, 30, 50, 70, 90 i 100%) na lodzie przez 10 min dla każdego etapu. Próbki w etapie 100% acetonu były pozostawione do osiągnięcia temperatury pokojowej przed kolejną zmianą w 100% acetonie przed suszeniem w punkcie krytycznym z ciekłym CO2 (CPD 30, Balzers, Liechtenstein). Wysuszone próbki pokrywano warstwą palladowo-złotą poprzez napylanie (SCD 500, Bal-Tec, Liechtenstein) przed badaniem w skaningowym mikroskopie elektronowym z emisją polową Zeiss Merlin (Oberkochen, Niemcy) przy użyciu detektora HESE2 Everhart Thornley SE i detektora SE w obiektywie w stosunku 25:75 przy napięciu przyspieszającym 5 kV.

Transmisyjna mikroskopia elektronowa: bakterie utrwalano jak wyżej i dalej utrwalano tetratlenkiem osmu (1% w buforze HEPES) przez 1 h w temperaturze pokojowej. Po przemyciu buforem HEPES, próbki odwodniono 10, 30 i 50% acetonem na lodzie przed inkubacją w 70% acetonie z 2% octanem uranylu przez noc w temperaturze 7 °C. Próbki były dalej odwadniane 90 i 100% acetonem na lodzie, pozwalano im dojść do temperatury pokojowej i dalej odwadniano 100% acetonem, a następnie zmieniano na 100% etanol. Następnie próbki infiltrowano aromatyczną żywicą akrylową LRWhite. Po polimeryzacji przez 2 dni w temperaturze 50 °C, ultracienkie skrawki wycinano nożem diamentowym, zbierano na siatki o oczkach 3000 pokryte butwarem i barwiono 4% wodnym octanem uranylu przez 3 min. Próbki obrazowano w aparacie TEM 910 firmy Zeiss przy napięciu przyspieszającym 80 kV i przy skalibrowanych powiększeniach.

Kontrast i jasność dostosowano za pomocą programu Adobe Photoshop CS3.

Generowanie przeciwciał

Przeciwciała poliklonalne przeciwko analizowanym CBP były hodowane u myszy przy użyciu rutynowych protokołów immunizacji. W skrócie, myszy CD-1 immunizowano dootrzewnowo 20 µg rekombinowanego białka i niekompletnym adiuwantem Freunda (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Niemcy) (50:50 v/v). W 14 i 28 dniu, myszy otrzymywały 20 µg białka i niekompletny adiuwant Freunda (50:50 v/v). Myszy wykrwawiono w 42. dniu, a poliklonalne IgG oczyszczono z surowicy przy użyciu białka A-Sepharose (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Niemcy). Przeciwciała wymieniono w Tabeli uzupełniającej 2.

Cytometria przepływowa

S. pneumoniae D39 typ dziki, jego izogeniczny mutant takL i mutant komplementarny hodowano w podłożu THY do połowy fazylog, zbierano przy 3,275×g przez 6 min i przemywano PBS (pH 7,4). W celu ilościowego oznaczenia zawartości otoczek, 100 µl zawiesiny zawierającej 4 × 108 bakterii inkubowano z antysurowicą polisacharydową przeciwko otoczkom (SSI Type serum 2, Statens Serum Institute) (1:500 w PBS) przez 30-45 min w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na płytkach 96-dołkowych (U-bottom, Greiner Bio-One). Po przemyciu, próbki inkubowano z drugorzędowym kozim przeciwciałem anty-rabbitowym IgG sprzężonym ze znakowanym Alexa488 (Invitrogen) (1:500 w PBS, 30-45 min, 37 °C). Po przemyciu PBS, bakterie utrwalono 1% formaldehydem przez noc w 4 ° C.

Obfitość CBP, jak również ilość kwasów teichoinowych w niekapsułkowanych szczepach D39 typu dzikiego, zmutowanych i uzupełnionych zmierzono za pomocą cytometrii przepływowej po utrwaleniu 1% formaldehydem przez 1 godzinę w 4 ° C. Dwieście µl zawiesiny zawierające 8 × 108 bakterii inkubowano ze specyficznymi przeciwciałami poliklonalnymi przeciwko różnym CBPs (1:500 w PBS), lub dla oznaczenia ilościowego TAs z przeciwciałami przeciwko P-Cho (TEPC-15) lub antygenowi Forssmana (15 min w 37 °C i 5% CO2) w płytkach 96-dołkowych (U-bottom, Greiner Bio-One). Po przemyciu, próbki inkubowano z drugorzędowym kozim przeciwciałem anty-IgG sprzężonym z przeciwciałem znakowanym Alexa488 (Invitrogen) (15 min, 37 °C). Fluorescencję oznaczano przy użyciu urządzenia FACS Calibur™ (BD Biosciences).

Analiza immunoblotów

S. pneumoniae D39, jego izogeniczny mutant takL i mutant komplementarny hodowano w podłożu THY do osiągnięcia A 600 0,35-0,45, zbierano przez wirowanie przy 3270×g w temperaturze 4 °C przez 6 minut i zawieszano w 1 ml buforu PBS o pH 7,4. Łącznie 2 × 108 komórek na dołek było ładowanych i poddawanych 12% SDS-PAGE przed przeniesieniem na membranę nitrocelulozową metodą semidry blotting. Membrany były blokowane przez 2 godziny w temperaturze pokojowej przy użyciu 5% mleka odtłuszczonego (Roth) i soli fizjologicznej buforowanej Tris (TBS; pH 7,4) i inkubowane przez noc w 4 °C z mysimi przeciwciałami poliklonalnymi przeciwko różnym CBP (1:500 w 5% mleku odtłuszczonym + TBS 0,01% Tween (T-TBS)). Królicze przeciwciało poliklonalne przeciwko enolazie (1:25,000 w 5% mleku odtłuszczonym + T-TBS) zostało użyte jako kontrola obciążenia. Membrany przemywano T-TBS, CBP wykrywano za pomocą drugorzędowego barwnika fluorescencyjnego IRDye® 800CW. Kozie α-mysie IgG i enolazę wykryto za pomocą znakowanego fluorescencyjnie IRDye® 680RD. Przeciwciało kozie α-rabbit IgG wykrywano poprzez inkubację z odpowiednim przeciwciałem (1:15,000 w 5% mleku odtłuszczonym w T-TBS) przez 45 min w ciemności w temperaturze pokojowej; membrany przemywano T-TBS i na koniec raz TBS. Skanowanie membran przeprowadzono przy użyciu skanera Odyssey® CLx (LI-COR).

Triton X-100-induced autolysis assay

S. pneumoniae D39 wild-type, mutant, and complemented strain were cultivated in THY medium to mid-log phase, harvested at 3275×g for 6 min, and washed with PBS (pH 7.4). Zawiesinę o objętości 1 ml zawierającą 1 × 109 bakterii inkubowano z końcowym stężeniem 0,01% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Niemcy) i inkubowano w temperaturze 37 °C. Liza komórek bakteryjnych była monitorowana przez pomiar absorbancji przy długości fali 600 nm we wcześniej określonych punktach czasowych.

Atest adherencji do nabłonka

Pneumokokowe przyleganie do komórek nabłonka było analizowane przy użyciu ludzkich komórek A549 (ATCC® CCl-185TM), jak opisano48. Krótko mówiąc, konfluentne komórki nabłonka, hodowane na szklanych szkiełkach nakrywkowych (Hartenstein; w płytkach 24-dołkowych, ~ 1 × 105 komórek na studzienkę) zaszczepiono 5 × 106 średnio-ekspresyjnie rosnącymi pneumokokami i inkubowano w pożywce infekcyjnej (DMEM (HyClone™) + 1% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (FBS)) w temperaturze 37 ° C i 5% CO2. Następnie komórki przemywano trzykrotnie buforowanym fosforanami roztworem soli fizjologicznej zawierającym 1% FBS (Gibco), aby usunąć niezwiązane bakterie. Następnie bakterie utrwalano za pomocą PBS zawierającego 1% paraformaldehydu (PFA, Roth).

Mikroskopia immunofluorescencyjna

Utrwalone pneumokoki, związane z komórkami A549 przemywano trzykrotnie PBS i blokowano przez 1 h w temperaturze pokojowej za pomocą PBS + 10% FBS. Po płukaniu, próbki inkubowano przez 1 h w temperaturze pokojowej z przeciwciałem poliklonalnym (1:500, Davids Biotechnologie GmbH) przeciwko pneumokokom (wytworzonym u królika przeciwko inaktywowanym termicznie S. pneumoniae TIGR4 i D39). Jako przeciwciała drugorzędowego użyto znakowanego fluorescencyjnie koziego przeciwciała anty-rabbitowego Alexa-Fluor488 (Abcam) (1:500, 1 h, temperatura pokojowa). Przyleganie bakterii było monitorowane dla co najmniej 20 komórek na klasę szkiełek nakrywkowych przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego. Każdy eksperyment powtórzono trzykrotnie w dwóch egzemplarzach. Wszystkie dane przedstawiono jako średnie ± s.d. Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu niesparowanego, dwuwarstwowego testu t-Studenta. We wszystkich analizach wartość p <0,05 uznano za statystycznie istotną.

Doświadczenia fagocytozy

Test ochrony antybiotykowej: Konfluentną warstwę monocytarnych komórek THP-1 (ATCC® TIB-202TM) hodowanych w 24-dołkowych płytkach (3 × 105 komórek na studzienkę w RPMI-1640 (HyClone™) uzupełnionym 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS, Gibco)) różnicowano do fagocytów przez dodanie 200 nmol ml-1 fosforanu 12-myristanu 13-octanu (PMA, Sigma-Aldrich) i inkubowano przez 48 h w 37 °C i 5% CO2. Następnie komórki THP-1 przemywano preparatem RPMI-1640 uzupełnionym 10% FBS inaktywowanym termicznie i inkubowano przez kolejne 24 h w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Przed zakażeniem pneumokoki hodowano w THY do fazy mid-log (A 600 = 0,35-0,45), odwirowywano i przemywano pożywką infekcyjną (RPMI-1640 uzupełnioną 1% FBS inaktywowanym termicznie). Komórki THP-1 płukano i zakażano pneumokokami w 500 µl podłoża infekcyjnego. Infekcję synchronizowano przez wirowanie (2 min, 300×g), aby zainicjować jednoczesny kontakt bakterii i fagocytów. Następnie komórki inkubowano w temperaturze 37°C i 5% CO2 przez różne okresy czasu. Po zakażeniu, komórki przemywano podłożem infekcyjnym i inkubowano z Penicyliną G (100 jednostek ml-1, Sigma-Aldrich) i Gentamycyną (0,1 mg ml-1, Sigma-Aldrich) przez 1 h w 37 °C i 5% CO2 w celu zabicia bakterii pozakomórkowych. Następnie fagocyty płukano i lizowano 1% saponiną (Sigma-Aldrich) w celu uwolnienia wewnątrzkomórkowych pneumokoków. Jednostki tworzące kolonię (cfu) bakterii wewnątrzkomórkowych określano przez posiew bakterii w odpowiednich rozcieńczeniach na płytki z agarem krwawym (Oxoid)49. Zależne od czasu zabijanie pneumokoków wewnątrzkomórkowych oceniano przez zabijanie pneumokoków zewnątrzkomórkowych za pomocą antybiotyków, jak opisano powyżej. Następnie fagocyty były dalej inkubowane w podłożu infekcyjnym przez różne okresy czasu (0-3 h). Wewnątrzkomórkowe cfu bakteryjne były monitorowane jak opisano powyżej. Wszystkie eksperymenty powtarzano czterokrotnie jako duplikaty. Dane zostały znormalizowane w testach ochrony antybiotykowej do mnogości infekcji (MOI) lub w testach zabijania zależnego od czasu do odzyskanych bakterii w punkcie czasowym 0 h. Wszystkie testy były analizowane przy użyciu jednokierunkowej ANOVA z poprawką Bonferroniego.

Barwienie podwójną immunofluorescencją i mikroskopia

Zróżnicowane pod wpływem PMA komórki THP-1 (3 × 105 komórek na studzienkę) hodowano na sterylnych szklanych szkiełkach nakrywkowych (12 mm, Hartenstein) i zakażano pneumokokami, jak opisano powyżej. Po zakażeniu, komórki THP-1 przemywano pożywką infekcyjną i utrwalano 4% paraformaldehydem (Roth) przez noc w temperaturze 4 °C. Szklane szkiełka nakrywkowe przemywano PBS i blokowano PBS + 10% FBS inaktywowanym termicznie przez 1 h. Po przemyciu, bakterie pozakomórkowe barwiono przy użyciu poliklonalnej α-pneumokoków IgG (1:500) i drugorzędowej koziej α-rabbitowej IgG znakowanej Alexa-Fluor488 (1:500, Abcam) przez 30 min w temperaturze pokojowej. Szklane szkiełka nakrywkowe przemywano trzykrotnie PBS po permeabilizacji komórek THP-1 za pomocą 0,1% Tritonu X-100 w PBS (10 min, temperatura pokojowa). Po przemyciu, wewnątrzkomórkowe pneumokoki barwiono przy użyciu poliklonalnej α-pneumokoków IgG (1:500) i drugorzędowej koziej α-rabbitowej IgG znakowanej Alexa-Fluor568 (1:500, Abcam) przez 30 min w temperaturze pokojowej. Eksperymenty powtarzano trzykrotnie jako duplikaty. Do analizy statystycznej, 50 komórek na szklanym szkiełku nakrywkowym analizowano pod kątem liczby bakterii wewnątrzkomórkowych. Dane zostały znormalizowane do MOI. Wszystkie testy były analizowane przy użyciu jednokierunkowej ANOVA z korektą Bonferroniego. We wszystkich analizach, wartość p <0,05 uznano za statystycznie istotną.

Linie komórkowe

Wszystkie linie komórkowe użyte w tym badaniu zostały zakupione od ATCC (A549: ATCC CCL-185; THP-1: ATCC TIB-202) i zostały przetestowane jako mykoplazmoujemne przez PCR i skaningową mikroskopię elektronową.

Ostre zapalenie płuc u myszy i model zakażenia ogólnoustrojowego

Ośmio- do dziesięciotygodniowe samice myszy CD-1 (outbred, Charles River, Sulzfeld, Niemcy) zostały zainfekowane donosowo bioluminescencyjnymi pneumokokami, jak opisano ostatnio50. Krótko mówiąc, pneumokoki hodowano do połowy fazy wykładniczej (A 600 = 0,35) w podłożu THY zawierającym 10% inaktywowanej cieplnie płodowej surowicy bydlęcej. Po odwirowaniu dawkę zakażenia (20 µl) dostosowywano do ~2,5 × 107 cfu w PBS (pH 7,4). W celu zakażenia nosa myszy znieczulano poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie ketaminy/ksylazyny (Ketanest S, Pfizer Pharma, Karlsruhe, Niemcy; Rompun, Provet AG, Lyssach, Niemcy), a bakterie podawano kroplami do nozdrzy. Cfu dawki infekcyjnej potwierdzano przez posiew seryjnych rozcieńczeń inokulum na płytki agarowe z krwią. Myszy monitorowano pod kątem przeżycia i obrazowano bioluminescencję we wcześniej wybranych odstępach czasu przy użyciu systemu IVIS® Spectrum Imaging System (Caliper Life Sciences, Hopkinton, USA). W przypadku modelu zakażenia ogólnoustrojowego, dawkę 3 × 103 cfu podawano dootrzewnowo w objętości 200 µl PBS (pH 7,4). Wszystkie doświadczenia na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z niemieckimi przepisami Towarzystwa Nauk o Zwierzętach Laboratoryjnych (GV-SOLAS) oraz europejskim prawem zdrowotnym Federacji Stowarzyszeń Nauk o Zwierzętach Laboratoryjnych (FELASA). Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone przez Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei Mecklenburg – Vorpommern (LALLFV M-V, Rostock, Niemcy, zezwolenie nr 7221.3-1-056/16-1).

Dostępność danych

Raw FASTQ files containing S. pneumoniae genomic sequence data were submitted to the EMBL-EBI European Nucleotide Archive (ENA) and stored in the Short Read Archive (SRA) under the study accession number RJEB18558. Wszystkie inne istotne dane potwierdzające wyniki badania są dostępne w tym artykule i jego plikach Supplementary Information lub u odpowiednich autorów na życzenie.