Synonimy

Nieestryfikowane kwasy tłuszczowe (NEFA), wolne kwasy tłuszczowe, nienasycone kwasy tłuszczowe

Fizjologia

Nieestryfikowane („wolne” lub nienasycone) kwasy tłuszczowe (NEFA) są głównym składnikiem triglicerydów (zapasów tłuszczu w organizmie), które składają się z trzech kwasów tłuszczowych połączonych z szkieletem glicerolu. U zdrowych zwierząt (kiedy jedzą lub nie znajdują się w stanach niedoboru energii), NEFA pochodzą głównie z rozkładu trójglicerydów spożytych w diecie przez chylomikrony (lipaza lipoproteinowa uwalnia NEFA z resztek chylomikronów). Jednakże, w warunkach postu lub stanach ujemnego bilansu energetycznego, głównym źródłem NEFA jest hydroliza zapasów tłuszczu w organizmie.

Hydroliza przechowywanych triglicerydów (tłuszcz) w tkance tłuszczowej przez hormonowrażliwą lipazę uwalnia NEFAs i glicerol. Hormonowrażliwa lipaza (która znajduje się w cytosolu adipocytów) jest stymulowana przez różne hormony, w tym glukagon (który jest uwalniany z komórek α w wysepkach trzustki w odpowiedzi na niski poziom glukozy) i kortykosteroidy. Po uwolnieniu z tłuszczu lub chylomironów, NEFAs mogą być wykorzystywane jako źródło energii przez wiele tkanek, w tym mięśnie szkieletowe i hepatocyty. W hepatocytach ich los różni się w zależności od potrzeb energetycznych, równowagi hormonalnej i dostępności substratów, tj. mogą być wykorzystywane do produkcji energii (poprzez cykl Kreb’a), ponownie pakowane w trójglicerydy i eksportowane jako lipoproteiny o bardzo niskiej gęstości (VLDL) lub przechowywane w wątrobie jako trójglicerydy (których nadmiar może powodować lipidozę wątrobową) lub przekształcane w ketony.

Metodologia

Podstawową metodą pomiaru stężenia NEFAs w surowicy jest kolorymetryczna metoda enzymatyczna, która jest metodą stosowaną na Uniwersytecie Cornella.

Reakcja typu

Reakcja z zaślepionym punktem końcowym. Ślepa próba zmniejsza wpływ hemolizy na stężenie NEFA.

Procedura stosowana na Uniwersytecie Cornella

W pierwszym etapie tej trzystopniowej reakcji, syntetyzator acylo-CoA (ACS) katalizuje acylowanie NEFA do (koenzymu A) CoA, w wyniku czego powstaje acylo-CoA. Nadtlenek wodoru jest następnie generowany z utleniania acylo-CoA przez katalityczne działanie oksydazy acylo-CoA (ACOD). Wreszcie, nadtlenek wodoru w obecności peroksydazy (POD) umożliwia oksydacyjną kondensację 4-aminoantypiryny z 3-metylo-N-etylo-N-(β-hydroksyetylo)-aniliną (MEHA), tworząc niebiesko-purpurowy produkt końcowy o maksimum absorbancji przy 550 nm. Stężenie NEFA jest wprost proporcjonalne do zmierzonej gęstości optycznej produktu barwnika.

Reakcje są przedstawione poniżej:

NEFA+ ATP + CoA syntaza acylo-CoA > Acylo-CoA + AMP + pirofosforan

Acylo-CoA + O2 + oksydaza acylo-CoA > 2,3-trans-Enoyl-CoA + H2O2

2H2O2 + 4-aminoantypiryna + peroksydaza MEHA >kompleks niebiesko-purpurowy+ 3H2O

Jednostki miary

Stężenie NEFAs jest mierzone w mEq/L (jednostki konwencjonalne) lub mmol/L (jednostki SI). Przeliczenie jednostek uzyskuje się z następującego wzoru:

mEq/L x 1= mmol/L

Uwagi dotyczące próbki

Rodzaj próbki

Serum lub osocze EDTA. Surowica/osocze powinny być oddzielone od komórek natychmiast po pobraniu, a surowica/osocze umieszczone w oddzielnej probówce. Podobnie nie zaleca się stosowania probówek corvac (z separatorem surowicy), ponieważ wartości są w nich nieznacznie (ale znacząco) wyższe w porównaniu z probówkami bez antykoagulantu (z czerwoną górną częścią).

Antykoagulant

EDTA. Wartości są mniej stabilne w heparynie, która również daje wyższe stężenia wyjściowe niż EDTA lub surowica, a wartości NEFA wzrastają wraz z przechowywaniem (Stokol i Nydam 2005).

Stabilność

Stabilne w surowicy bydlęcej lub osoczu EDTA w temperaturze 4°C przez 72 godziny. Stabilny w stanie zamrożonym w surowicy bydlęcej przez 1 miesiąc (-70°C). Wartości wzrastały w ciągu 24-48 godzin po przechowywaniu w temperaturze 24°C w surowicy lub osoczu z EDTA. Stężenia NEFA szybko wzrastają w heparynie po przechowywaniu. (Stokol i Nydam 2005).

Zalecenia dotyczące pobierania próbek u krów mlecznych w okresie przejściowym

• Antykoagulant: Czerwony wierzchołek (surowica) lub fioletowy wierzchołek (EDTA). Unikać probówek z heparyną (zielona górna część) i Corvac (separator surowicy).
• Postępowanie: Oddzielić od komórek ASAP, przechowywać w chłodnym miejscu, aby zminimalizować fałszywe zmiany w wynikach (NEFA są szczególnie niestabilne), dostarczyć ASAP do laboratorium.
• Czas pobierania: Próbki pobierać od krów w momencie, gdy wchodzą do boksów paszowych (patrz niżej).
  • Prepartum NEFAs: Pobierać próbki od krów na 2-14 dni przed wycieleniem.
  • Postpartum NEFAs: Pobrać próbki od krów 3-14 dni w mleku. Pomiar zarówno poporodowych NEFAs jak i BHB jest wykonywany w profilu energetycznym krowy przejściowej w celu oceny statusu energetycznego u krów w okresie laktacji w Laboratorium Patologii Klinicznej w Cornell University.
• Liczba krów: Do badania na poziomie stada należy pobrać próbki od co najmniej 12 zwierząt ze stada (opis badania w części dotyczącej interpretacji badania poniżej). Może to być mieszanka jałówek i krów w dwóch parytetach.
• Połączone próbki: Łączenie indywidualnych próbek od krów w celu oceny statusu energetycznego stada NIE jest zalecane. Badania przeprowadzone na Cornell University wykazały, że wyniki z próbek zbiorczych są mniej czułe niż badanie poszczególnych krów (minimum 12 zwierząt w stadzie) przy stosowaniu przedporodowego lub poporodowego NEFA do wykrywania nadmiernego ujemnego bilansu energetycznego u przejściowych krów mlecznych.

Interferencje

• Lipemia, icterus: Nieznane działanie (rzadko u bydła).
• Hemoliza: W zależności od metody stosowanej przez laboratorium, hemoliza będzie albo obniżać albo podwyższać wartości NEFA. W metodzie ślepej próby stosowanej na Uniwersytecie Cornell, ciężka hemoliza (indeks hemolityczny > 800 jednostek) łagodnie obniży stężenie NEFA we krwi bydlęcej. Lipemiczne i ikteryczne czynniki zakłócające nie wpływają znacząco na stężenie NEFAs w metodach stosowanych przez Cornell University.
• Pobudzenie/ćwiczenie/stres: Warunki te, które indukują uwalnianie katecholamin lub ACTH, zwiększają stężenia NEFA poprzez stymulację lipolizy za pośrednictwem lipazy wrażliwej na hormony. Warunki te powinny być zminimalizowane podczas pobierania próbek krwi do pomiaru NEFA.
• Czas pobierania próbek: Wartości NEFA są prawdopodobnie wyższe u krów, które przychodzą na codzienne karmienie (prawdopodobnie są w pewnym stopniu w ujemnym bilansie energetycznym) w porównaniu z tymi krowami, które właśnie zostały nakarmione (lipoliza będzie zahamowana u tych ostatnich). Zalecane jest pobieranie tuż przed karmieniem.

Interpretacja testu

TestowanieNEFA jest najczęściej wykonywane u bydła mlecznego w celu określenia, czy stado jest w nadmiernym ujemnym bilansie energetycznym. Jest ono stosowane bardziej na poziomie stada niż pojedynczego zwierzęcia, a wyniki są interpretowane w odniesieniu do stężenia granicznego lub odsetka zwierząt z wartościami powyżej wartości granicznej w porównaniu z wartościami powyżej górnej granicy odniesienia. Pomiar NEFA może być wykonywany u każdego innego gatunku jako marker nadmiernego ujemnego bilansu energetycznego. Jest to najczęściej wykonywane u wielbłądowatych (u których w takich okolicznościach dochodzi do rozwoju lipidozy wątrobowej), innych przeżuwaczy (np. kóz, owiec) w celu określenia, czy są one zagrożone ketozą, oraz koni (z zespołem metabolicznym koni). Należy pamiętać, że stężenia poniżej granicy referencyjnej nie mają znaczenia klinicznego.

Zwiększone stężenia

• Fizjologiczne: Ćwiczenie wywołuje uwalnianie katecholamin i ACTH, które stymulują aktywność hydrolityczną lipazy wrażliwej na hormony w celu promowania mobilizacji tłuszczu, aby sprostać nadmiernemu zapotrzebowaniu na energię. Proces ten zwiększa stężenie NEFAs we krwi.
• Różnice rasowe: Kilka badań wykazało, że NEFAs są niższe u krów rasy Jersey po porodzie w porównaniu do krów rasy Holstein, stąd wytyczne opracowane dla krów rasy Holstein (patrz poniżej) mogą nie mieć zastosowania do krów rasy Jersey (Rastani i wsp. 2001, French 2006, Guretsky i wsp. 2006, Brown i wsp. 2012).
• Ujemny bilans energetyczny u krów mlecznych: Krowy mleczne w okresie okołoporodowym (przejściowym) są zawsze w stanie ujemnego bilansu energetycznego ze względu na wysokie zapotrzebowanie na energię ze strony rozwijającego się płodu i produkcji mleka (szczególnie przy nacisku na selekcję na wysokomleczne). Jednakże, ten stan ujemnego bilansu energetycznego może być nadmierny i dotknięte nim krowy są narażone na choroby żołądkowo-jelitowe (przemieszczony brzuch), metaboliczne (kliniczna ketoza) i zakaźne (np. metritis) we wczesnym okresie poporodowym. Dlatego też, lekarze mleczarze często monitorują stada mleczne pod kątem nadmiernego ujemnego bilansu energetycznego poprzez badanie NEFAs, albo samodzielnie u krów przed lub po porodzie, albo jako składnik profilu metabolicznego u krów po porodzie. Wyniki tych badań mogą być interpretowane na poziomie pojedynczej krowy (tj. wartość NEFA powyżej określonego punktu odcięcia wskazuje na nadmiar ujemnego bilansu energetycznego) lub na poziomie stada (tj. proporcja badanych krów ma wartości NEFA powyżej określonej wartości odcięcia). Identyfikacja nadmiaru ujemnego bilansu energetycznego u pojedynczych krów (i co ważniejsze) w stadzie wskazuje na potrzebę zmian w żywieniu (np. zwiększenie przestrzeni paszowej na pryczy, zwiększenie gęstości energetycznej dawki pokarmowej) oraz w zarządzaniu krowami przejściowymi w celu zmniejszenia zapotrzebowania na energię i stresu krów przejściowych. Poniższe wytyczne interpretacyjne są oparte na badaniach przeprowadzonych na Uniwersytecie Cornell i są ważne dla próbek pobranych od „zagrożonych” krów rasy holsztyńskiej żywionych TMR pomiędzy 2-14 dniem przed wycieleniem (przedporodowe NEFA) lub 3-14 dniem po wycieleniu (poporodowe NEFA). Zalecamy pobranie prób od co najmniej 12 krów „z grupy ryzyka” podczas oceny stad żywionych TMR (Total Mixed Ration) pod kątem podklinicznej ketozy (Ospina i wsp. 2013).
  • Badanie poziomu krów
    • Przedporodowe NEFAs: Istnieje zwiększona częstość występowania chorób po wycieleniu (przemieszczony brzuch, metritis/retained placenta i kliniczna ketoza), zmniejszona wydajność mleczna i zmniejszona wydajność reprodukcyjna w pierwszych 30 dniach w mleku u krów mlecznych rasy holsztyńskiej (karmionych TMR) z wartościami NEFA > 0,30 mEq/L przy badaniu na 2-14 dni przed wycieleniem.
    • Postpartum NEFAs: Istnieje zwiększona częstość występowania chorób poporodowych (przemieszczony brzuch, metritis/retained placenta i kliniczna ketoza), zmniejszona wydajność mleczna i zmniejszona wydajność reprodukcyjna w pierwszych 30 dniach w mleku u krów mlecznych rasy holsztyńskiej (karmionych TMR) z wartościami NEFA > 0,60-0,70 mEq/L, gdy testowane 3-14 dni po wycieleniu. W badaniach Cornell, po wycieleniu NEFA były faktycznie lepszym predyktorem niż po wycieleniu stężenia β-hydroksymaślanu lub przed wycieleniem NEFA.
  • Badanie na poziomie stada
    • Prepartum NEFAs: Na poziomie stada, istnieje znacząco zwiększone ryzyko wystąpienia po wycieleniu chorób metabolicznych i zakaźnych, zmniejszonej produkcji mleka lub zmniejszonej wydajności reprodukcyjnej, jeśli >15% badanych krów przed wycieleniem ma wartości NEFA > 0,30 mEq/L. Należy zauważyć, że jak wskazano powyżej, łączenie próbek od poszczególnych krów nie jest zalecane do badania na poziomie stada.
    • Postpartum NEFAs: Na poziomie stada, istnieje znacznie zwiększone ryzyko wystąpienia po wycieleniu chorób metabolicznych i zakaźnych, zmniejszonej produkcji mleka lub zmniejszonej wydajności reprodukcyjnej, jeśli >15-20% badanych krów po wycieleniu ma wartości NEFA > 0,70 mEq/L. Należy zauważyć, że jak wskazano powyżej, łączenie próbek od poszczególnych krów nie jest zalecane do badania na poziomie stada.
• Lipidoza wątrobowa u bydła mlecznego: W jednym z badań, stosunek NEFA:cholesterol >0,2 (jednostki SI) miał 9,9 iloraz szans na to, że zwierzę będzie miało lipidozę wątrobową (zdefiniowaną jako >10% zawartości lipidów w wątrobie), przy czym ten punkt odcięcia był bardziej czuły (63% przy 85% specyficzności) niż BHB, sam NEFA lub aktywność AST (>120 U/L) dla rozpoznania lipidozy wątrobowej (w oparciu o obszar pod krzywą charakterystyki operacyjnej odbiornika lub AUC). Jednak zwierzęta w tym badaniu miały wykonane pomiary krwi w różnym czasie po laktacji (Mostafavi i wsp. 2013).
• Ujemny bilans energetyczny u małych zwierząt: Występuje przede wszystkim w cukrzycy. W stanie niedoboru insuliny lub insulinooporności dochodzi do utraty inhibicji lipazy wrażliwej na hormony. Zaburzenie równowagi regulacyjnej aktywności lipazy hormonowrażliwej zwiększa mobilizację tłuszczu z tkanki tłuszczowej do tkanki wątrobowej, podnosząc stężenie NEFAs.
• Ujemny bilans energetyczny u wielbłądów: Chore, zestresowane wielbłądowate, zwłaszcza ciężarne samice, są narażone na ryzyko rozwoju lipidozy wątrobowej. Pomiar NEFA może być wykonany w celu określenia, czy są one w ujemnym bilansie energetycznym. Wielbłądy z NEFA > 0.8 mEq/L (Tornquist et al 2001) są w grupie podwyższonego ryzyka wystąpienia lipidozy. Anorektyczne wielbłądy często mają NEFA, które są podwyższone, ale poniżej tej wartości i mogą nie rozwinąć lipidozy.