Oligo Morpholino są zaawansowanymi narzędziami do blokowania miejsc na RNA w celu utrudnienia procesów komórkowych. Oligo Morpholino wiąże się specyficznie do wybranego miejsca docelowego, aby zablokować dostęp składników komórki do tego miejsca docelowego. Ta właściwość może być wykorzystana do blokowania translacji, blokowania splicingu, blokowania miRNA lub ich celów oraz blokowania aktywności rybozymów.
Blokowanie translacji: Poprzez sterylne blokowanie kompleksu inicjującego translację, Morpholinos mogą całkowicie zablokować ekspresję wielu sekwencji docelowych na tyle, że po odczekaniu na degradację istniejącego białka, pasmo białka docelowego znika z Western blot. W przeciwieństwie do wielu typów antysensów (np. siRNA, fosfotioany), morfolinozy generalnie nie powodują degradacji docelowego RNA; zamiast tego blokują aktywność biologiczną docelowego RNA do momentu, aż RNA ulegnie naturalnej degradacji, co spowoduje uwolnienie morfolino. Oznacza to, że RT-PCR nie nadaje się do oznaczania blokowania translacji przez morfoliny.
Blokowanie splotów: Poprzez blokowanie miejsc zaangażowanych w splicing pre-mRNA, Morfoliny mogą być używane do modyfikacji i kontroli normalnego splicingu. Aktywność ta może być wygodnie oceniana za pomocą RT-PCR, przy czym udana modyfikacja splicingu objawia się jako zmiany w paśmie produktu RT-PCR na żelu elektroforetycznym. Pasmo może przesunąć się do nowej masy lub, jeśli modyfikacja splotu wyzwala nonsensowny rozpad transkryptu, pasmo z dzikim splotem straci na intensywności lub zniknie.
Jak wszystkie odczynniki knockdown genów, Morpholinos muszą być aktywnie dostarczane do większości komórek. Morfolinozy mogą być dostarczane do komórek hodowlanych za pomocą różnych metod, włączając w to ładowanie komórek przylegających, elektroporację, a nawet mikroiniekcję. Jednakże, nasz odczynnik Endo-Porter generalnie zapewnia doskonałe dostarczanie do komórek hodowlanych pod względem ilości Morpholino dostarczanych na komórkę, równomiernego rozkładu w całej populacji komórek, odtwarzalności dostarczania i braku toksyczności dla większości typów komórek w zalecanym stężeniu. W przypadku doświadczeń na zwierzętach nasze Vivo-Morpholinos z dołączoną cząsteczką dostarczającą wchodzą do komórek z krwi po podaniu i.v. lub wchodzą do komórek w tkankach otaczających miejscowe zastrzyki; są one również najwygodniejszymi oligos antysensowymi do stosowania w hodowlach komórkowych lub eksplantatach, ponieważ nie wymagają żadnego dodatkowego środka do dostarczania cytozolowego.

Oligo morfolinowe radykalnie różni się od naturalnych kwasów nukleinowych, z pierścieniami metylenomorfoliny zastępującymi ugrupowania cukrowe rybozy lub deoksyrybozy i niejonowymi wiązaniami fosforodiamidowymi zastępującymi anionowe fosforany DNA i RNA. Każdy pierścień morfolinowy odpowiednio pozycjonuje jedną ze standardowych zasad DNA (A,C,G,T) do sparowania, dzięki czemu 25-zasadowe oligo Morpholino silnie i specyficznie wiąże się z komplementarnym 25-zasadowym miejscem docelowym w nici RNA poprzez sparowanie Watsona-Cricka. Ponieważ nienaładowany szkielet oligo Morpholino nie jest rozpoznawany przez enzymy, jest on całkowicie stabilny wobec nukleaz.
Zachęcamy Państwa do wprowadzenia bardziej precyzyjnego i potężnego narzędzia w celu sprostania Państwa wyzwaniom eksperymentalnym. Zadzwoń do naszej grupy wsparcia klienta na poziomie Ph.D.-level w Gene Tools, aby zacząć używać Morpholinos w swoich badaniach. Telefon: (541) 929-7840 wew. 1.

1. Ocena dostarczania

Jak w przypadku wszystkich środków do wybijania genów, skuteczne dostarczanie morfolino ma kluczowe znaczenie. Podczas gdy potwierdzenie dostarczenia nie jest kluczowe dla eksperymentów wykorzystujących mikroiniekcje embrionalne, potwierdzenie dostarczenia jest ważne dla eksperymentów z komórkami hodowanymi. Nasz odczynnik Endo-Porter zapewnia proste i niezawodne dostarczanie Morpholinos do większości typów komórek. Można ocenić, czy dostarczenie do cytozolu komórek jest prawidłowe, używając Morpholino znakowanego fluorescencyjnie. Zalecamy użycie do tego celu naszego niedrogiego oligo Standard Control znakowanego fluoresceiną.
Przy użyciu fluorescencyjnego Morpholino w celu potwierdzenia dostarczenia, należy rozpocząć od stężenia 10 mikroMolar Morpholino oligo w medium hodowlanym. Jest to na tyle wysokie stężenie, że po 16 godzinach fluorescencyjnie znakowane Morpholino powinno być widoczne w cytozolu w mikroskopie fluorescencyjnym. Odwrócony mikroskop fluorescencyjny jest najlepszym wyborem do obserwacji komórek w płytkach hodowlanych. Obserwować żywe (nieutrwalone) komórki. Należy użyć suchego obiektywu o największej dostępnej aperturze numerycznej, aby zebrać jak najwięcej światła z komórek. Udane dostarczenie światła objawia się rozproszoną fluorescencją w całym cytozolu. Fluorescencja punktowa zwykle wskazuje, że oligo jest uwięzione w endosomach, więc zignoruj punktowe plamki i szukaj fluorescencji rozproszonej.
Do rzeczywistych eksperymentów dostarczania niestandardowej sekwencji Morpholino z Endo-Porterem, generalnie potrzebujesz stężenia tylko 1 do 5 mikroMolarów dla skutecznej blokady sterycznej większości mRNA.Do długotrwałego przechowywania roztworów podstawowych Morpholino najlepiej jest przechowywać je w postaci liofilizowanej, kolejnym najlepszym wyborem jest przechowywanie w roztworze w temperaturze pokojowej. Sporządzanie roztworów podstawowych Morpholino o stężeniu mniejszym lub równym 1 miliMolar pomaga uniknąć problemów z rozpuszczalnością. Cykle zamrażania-rozmrażania lub długotrwałe przechowywanie w temperaturze 4C mogą powodować wytrącanie się lub łączenie Morpholinos z pojemnikami i zmniejszać aktywność roztworu; zalecamy przechowywanie w temperaturze pokojowej w szczelnie zamkniętych pojemnikach, a w celu uniknięcia parowania w przypadku wadliwego zamknięcia fiolki, zaleca się przechowywanie zapasów w wilgotnym środowisku, takim jak humidor (np. słoik dzwonowy z otwartą zlewką wody). Należy uważać, aby nie dopuścić do wyschnięcia oligo, ponieważ ponowne rozpuszczenie wyschniętego oligo może być trudne lub niemożliwe (choć oligo liofilizowane rozpuszcza się dość łatwo). Trzymanie fiolki w ciemnym pudełku lub zawiniętej w folię jest dobrą praktyką, ponieważ oligo znakowane fluorem może ulec fotobieleniu w świetle. DNA, RNA i większość odczynników do knockdownu genów są zazwyczaj przechowywane w łaźni lodowej podczas eksperymentów, aby zminimalizować degradację przez nukleazy. Ponieważ Morfolino są całkowicie odporne na degradację enzymatyczną, a roztwory wodne są chemicznie stabilne przez nieokreślony czas (lata) w temperaturze pokojowej, zalecamy, aby podczas eksperymentów przechowywać roztwory podstawowe Morfolino w temperaturze pokojowej. Schładzanie roztworów w łaźni lodowej może spowodować wytrącenie się Morpholino.
Te środki ostrożności są więcej niż potrzebne dla większości sekwencji, ale ich rutynowe stosowanie pomaga uniknąć nieprzyjemnych niespodzianek w przypadku napotkania sekwencji o niskiej rozpuszczalności.

.