Wprowadzenie

4-hydroksy-l-prolina (hydroksyprolina) jest aminokwasem niebiałkowym, o masie cząsteczkowej 131,13g/mol, syntetyzowanym w wyniku potranslacyjnej hydroksylacji proliny podczas biosyntezy kolagenu (ryc. 1). W badaniach nad fizjologicznym i patologicznym metabolizmem kolagenu najczęściej wykorzystuje się pomiar stężenia hydroksyproliny w osoczu, moczu i tkankach organizmu. Dlatego też oznaczenie hydroksyproliny dostarcza informacji przydatnych w diagnostyce i prognozowaniu chorób spowodowanych zaburzeniami metabolizmu kolagenu (1). Takie warunki obejmują nadczynność tarczycy, nadczynność przytarczyc, akromegalię, chorobę Pageta, osteomalację, krzywicę, zespół Marfana, osteogenezę niedoskonałą, sklerodaktylię, zapalenie skórno-mięśniowe i zespół Cushinga (2).

Włóknienie, które występuje w wątrobie, płucach, nerkach, skórze i innych narządach ma zdolność do rozwoju w przewlekłe zapalenie wątroby, stwardnienie wątroby, raka wątroby, zwłóknienie płuc i kłębuszkowe zapalenie nerek (3). Dlatego też zapobieganie rozwojowi i zmniejszenie nasilenia zwłóknienia u pacjentów jest bardzo ważne. Hydroksyprolina działa jako ważny wskaźnik diagnostyczny ciężkości zwłóknienia.

Pomiar hydroksyproliny w osoczu, moczu i tkankach ciała jest możliwy za pomocą metod kolorymetrycznych, wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) i wstrzykiwania przepływowego (4-6). Jednakże, metody te wymagają dużych objętości próbek, z powodu ich niskiej czułości. Ponadto, HPLC wymaga długiego czasu rozdzielania każdej próbki. W ostatnich latach, chromatografia cieczowa ze spektrometrią mas (LC-MS) stała się korzystna ze względu na wysoką czułość i krótki czas separacji. LC-MS została wykorzystana do pomiaru niskich stężeń leków w płynie i moczu z zanieczyszczonymi substancjami (7-9). Obecne badania miały na celu zastosowanie nowatorskiej metody LC-MS do pomiaru hydroksyproliny. Jako wskaźnik zwłóknienia, hydroksyprolina w wątrobie i płucach szczurzego modelu zwłóknienia została zmierzona za pomocą LC-MS i porównana z poprzednimi wynikami uzyskanymi za pomocąHPLC i metod kolorymetrycznych.

Materiały i metody

Oświadczenie etyczne

Protokół badania został zatwierdzony przez EthicsCommittee of Harbin Medical University (Harbin, Chiny). Standardowa procedura uzyskiwania pisemnej świadomej zgody została włączona do protokołu i została zatwierdzona przez Komitet Etyczny Uniwersytetu Medycznego w Harbinie.

Odczynniki

Dimetylo-nitrozoamina (DMN) i hydroksyprolina zostały uzyskane od Nacalai Tesque Inc. (Kyoto, Japonia). Nembutal został zakupiony od Dai-Nihon Pharmaceuticals Inc. (Osaka, Japonia), ableomycynę otrzymano z Nihon Kayaku Inc. (Tokio, Japonia). Allother chemicals were of reagent grade.

Preparation of a model of pulmonary andliver fibrosis in rats

A model of pulmonary fibrosis was created infive-week-old Wistar rats by injection of bleomycin (BLM, 0.30U/100 g, i.p.) do tchawicy w znieczuleniu nembutalem (50 mg/kg).Zdrowym szczurom wstrzykiwano 0,9% roztwór soli fizjologicznej (kontrola).

Model zwłóknienia wątroby utworzono u siedmiotygodniowych szczurów Wistar przez pojedyncze wstrzyknięcie DMN (40 mg/kg,i.p.). Kontrolę stanowiły zdrowe szczury, którym wstrzykiwano 0,9% roztwór soli fizjologicznej (kontrola). Przygotowanie modelu zwłóknienia wątroby płucnej i pobranie tkanki było oparte na metodach opisanych w poprzednich badaniach (10,11).

Measurement of hydroxyproline in a ratmodel of pulmonary fibrosis by a colorimetric method

Lewe płuco zostało usunięte, zważone (~0.3 g) i homogenizowano w 5% roztworze kwasu trichlorooctowego (objętość x10) przy użyciu homogenizatora komórek (Eilard, Berlin, Niemcy) przy 8000 × g (4°C) przez 2 min w łaźni lodowej. Komórki odwirowywano (2,500 × g, 4°C) przez 20 min, a supernatant przemywano dwukrotnie wodą destylowaną. Następnie dodawano 6 N HCl w temperaturze 110°C całkowicie na początku i reagowano przez 16 h. Po zakończeniu reakcji dodano toluen (3 ml) i mieszano mieszaninę przez 20 min. Po wirowaniu (3000 × g, 20°C) przez 10 min, zebrano warstwę organiczną i dodano p-dimetyloaminobenzaldehyd.Hydroksyprolina w próbce została wykryta przy użyciu spektrometru wielopłytkowego (Ultramark; Bio-Rad, Hercules, CA, USA) przy długości fali 560 nm.

Pomiar hydroksyproliny w wątrobie metodą HPLC

Lewe płuco usunięto, zważono (~0,3 g) i homogenizowano w 5 ml etanolu za pomocą homogenizatora komórkowego (Eilard) przy 8000 × g (4°C) przez 2 min w łaźni lodowej. Homogenat odwirowywano (2,500 × g, 4°C) przez 20 min i zbierano supernatant. Uzyskano płyn (1 ml), który ogrzewano przez 8 godzin w temperaturze 60°C aż do wyschnięcia. Po rozpuszczeniu pozostałości w 40 μl etanolu i 80 μl buforu boranowego (0,1 M, pH 8) dodano 40 μl4-fluoro-7-nitrobenzofurazanu (100 mM) jako odczynnika fluorescencyjnego. Reakcja była kontynuowana w temperaturze pokojowej przez 15 h w ciemności. Następnie dodano 840 μl kwasu chlorowodorowego (6 mol/l), aby zakończyć reakcję. Po odwirowaniu (2500 × g, 20°C) przez 20 min, supernatant usunięto do analizy HPLC.

Użyto systemu Hitachi L6000 HPLC (Hitachi HighTechnologies America, Inc., Schaumburg, IL, USA).Detekcję przeprowadzono za pomocą spektrometru fluorescencyjnego Hitachi L7480 (Hitachi High-Technologies Corporation, Tokio, Japonia; wzbudzenie przy 475 nm, emisja przy 530 nm). Kolumnę (Hitachi High-Technologies Corporation) stanowiła kolumna YMC Pack ODS-AQ (150×6,0 mmID) w temperaturze pokojowej. Fazą ruchomą był acetonitryl: woda(35:65-50:50 gradient przez 15 min), a szybkość przepływu wynosiła 1ml/min.

Measurement of hydroxyproline inpulmonary and liver organization by LC-MS

Lewe płuco zostało usunięte, zważone (~0.3 g) i homogenizowano w 5% roztworze kwasu trichlorooctowego (objętość x10) przy użyciu homogenizatora komórek (Eilard) przy 8000 × g (4°C) przez 2 min w łaźni lodowej. Komórki odwirowano (2,500 × g, 4°C) przez 20 min. Supernatant przemywano dwukrotnie wodą destylowaną. Następnie dodano 6 N HCl w temperaturze 110°C przez 16 h, a próbki przygotowano do pomiaru. Wątroba została usunięta, zważona (~0,3 g) i homogenizowana w 5 ml etanolu przy użyciu homogenizatora komórkowego (Eilard) przy 8000 × g (4°C) przez 2 min w łaźni lodowej. Homogenat odwirowywano (2,500 × g, 4°C) przez 20 min, zbierano supernatant i przygotowywano próbki do pomiarów.

Stężenie hydroksyproliny oznaczano metodą LC-MS przy użyciu systemu LC-MS2020 (Shimadzu Corp.,Kyoto, Japonia). W odniesieniu do LC, fazą ruchomą było 5%CH3CN-10 mM CH3COONH4. Kolumnę stanowił Shin-pack VP-ODS (o średnicy 150×2 mm). Szybkość przepływu wynosiła 0,2 ml/min. W odniesieniu do MS zastosowano chemiczną jonizację atmosferyczną (APCI). Zastosowano również detekcję jonów dodatnich. Napięcie elektronów sondy wynosiło 4,5 kV, a prąd sondy 4,2 μA. Temperatura sondy APCI wynosiła 250°C, a napięcie elektronowe na zakrzywionej linii desolwatacyjnej (CDL) -30,0 V. Temperatura CDL wynosiła 250°C, a temperatura bloku 20°C. Napięcie bias dla Q-array 1, 2 i 3 wynosiło odpowiednio 5.0, 25.0 i 35.0 V. Napięcie elektronowe RF Q-array wynosiło 150,0 V.

Analiza statystyczna

Różnice między grupami badano za pomocą jednokierunkowej analizy wariancji. Jeśli nie stwierdzono istotnej różnicy, różnicę między grupami zbadano metodą Bonferroniego. Korelacje badano za pomocą dwustronnego testu t. P<0,05 uznawano za wskazanie różnicy istotnej statystycznie.

Wyniki

Pomiar stężenia hydroksyproliny metodą LC-MS

ChromatogramMS hydroksyproliny

Widmo masowe hydroksyproliny przedstawiono na rycinie 2. MS wzorca hydroksyproliny (80 pg/ml) dało piki fragmentów o masie cząsteczkowej 173,0 (jon cząsteczkowy + kwas octowy-woda) wygenerowane z addycji do kwasu octowego amonu dla zwiększenia liczby cząsteczek jonowych (ilość cząsteczkowa, 131,15) i siły jonowej.

LC-MS chromatogram ofhydroxyproline

Warunki LC były następujące: faza ruchoma, 5%CH3CN-10 mM CH3COONH4; kolumna,Shin-pack VP-ODS (średnica 150×2 mm); szybkość przepływu, 0,2 ml/min i detekcjaultravioletowa (UV) przy 230 nm. MS przeprowadzono z zastosowaniem metody jonizacjiAPCI, a detekcja jonów była pozytywna.

Chromatogram LC-MS-selected ion monitoring (SIM) hydroksyproliny (m/z, 173,0) przedstawiono na Rys. 3. Jak zaobserwowano dla wzorca hydroksyproliny, pik był obserwowany przy 1 ng/ml przy czasie retencji 2,213 min. Ostry pik zaobserwowano również przy 50 ng/ml. Przy 1 μg/ml, co stanowiło 1000-krotność stężenia standardowego, w widmie LC-UV (230 nm) odnotowano mały pik.

Czułość detekcji LC-MS na hydroksyprolinę

Krzywą wzorcową LC-MS-SIM hydroksyproliny (m/z, 173,0; jon cząsteczkowy + kwas octowy-woda) przedstawiono na Rys. 4. Stosując metodę powierzchni piku dla krzywej wzorcowej, hydroksyprolina wykazywała ostry pik przy 35ng/ml (Rys. 3). Jednakże, w stężeniach <35 ng/ml nie zaobserwowano korelacji pomiędzy powierzchniami pików. W zakresie 35-560 ng/ml obserwowano korelację między powierzchniami pików, a krzywa standardowa była linią prostą. Przy 60 i 80 μg/ml, powierzchnie pików były prawie identyczne. Korelacja między obszarami pików nie była obserwowana przy stężeniach >60 μg/ml.

Chromatogram LC-MS i widmo MS hydroksyproliny w modelu zwłóknienia płuc i wątroby u szczurów

Fig. 5 przedstawia chromatogram LC-MS i widmo MS z detekcją SIM hydroksyproliny (m/z 173,0; jon molekularny + kwas octowy-woda) w modelu zwłóknienia płuc u szczurów. W chromatogramie LC-MS płuc, podobnie jak w przypadku wzorca hydroksyproliny, zaobserwowano wyraźny pik przy m/z 173,0 przy czasie retencji 2,213 min. Hydroksyprolina została zidentyfikowana przy m/z 131,15 w widmie masowym.

Rys. 6 ilustruje chromatogram LC-MS i widmo MS z detekcją SIM hydroksyproliny (m/z 173,0; jon cząsteczkowy + kwas octowy-woda) w zwłókniałej tkance wątroby szczurów. Jak zaobserwowano dla standardu hydroksyproliny, pik został odnotowany przy czasie retencji 2.213 min w chromatogramie LC-MS i widmie MS.

Stężenie hydroksyproliny w tkance płuc (metody kolorymetryczne i LC-MS)

Metody kolorymetryczne i LC-MS stosowane do oznaczania stężenia hydroksyproliny w tkance płuc szczurów są porównane na Rys. 7.Każda kolumna reprezentuje średnią ± odchylenie standardowe z dziewięciu doświadczeń. Zgodnie z metodą kolorymetryczną, stężenie hydroksyproliny w tkance płucnej szczura w grupie otrzymującej BLM (652.3±70.0 μg/lewe płuco) było znacząco wyższe w porównaniu z grupą kontrolną (547.1±52.3 μg/lewe płuco; P<0.05). Zgodnie z metodą LC-MS, grupa otrzymująca BLM (610.9±50.3 μg/lewe płuco) miała znacząco wyższą wartość w porównaniu z grupą kontrolną (493.3±53.5 μg/lewe płuco; P<0.05).Jednakże stężenie hydroksyproliny w tkance płuc szczura oznaczane metodą LC-MS miało niższą wartość w porównaniu z oznaczanym metodą kolorymetryczną.

Stężenia hydroksyproliny w tkance płuc szczura oznaczane metodą kolorymetryczną i LC-MS porównano na rycinie 8. Stwierdzono korelację pomiędzy metodami kolorymetryczną i LC-MS w oznaczaniu stężenia hydroksyproliny w tkance płucnej grupy kontrolnej (r=0,972). Podobnie zidentyfikowano korelację pomiędzy metodą kolorymetryczną i LC-MS dla oznaczenia stężenia hydroksyproliny w tkance płucnej grupy otrzymującej BLM (r=0,918).

Stężenie hydroksyproliny w tkance wątroby szczura metodą znakowania fluorescencyjnego i LC-MS

Ocena stężenia hydroksyproliny w tkance wątroby szczura metodą znakowania fluorescencyjnego i LC-MS została przedstawiona na rycinie 9. Zgodnie z metodą znakowania fluorescencyjnego, stężenie hydroksyproliny w tkance wątroby szczura z grupy otrzymującej DMN (105,4±36,5 μg/g) było znacząco wyższe w porównaniu z grupą kontrolną (30,3±2,7 μg/g; P<0,05). Również zgodnie z analiząLC-MS, grupa otrzymująca DMN (190.4±70.3 μg/g) wykazała istotnie wyższą wartość w porównaniu z grupą kontrolną (62.4±6.8 μg/g; P<0.05). Jednakże, stężenie hydroksyproliny w tkance wątroby szczura mierzone metodą LC-MS było wyższe w porównaniu z tym mierzonym metodą znakowania fluorescencyjnego.

Stężenie hydroksyproliny w tkance wątroby szczura oceniane metodami znakowania fluorescencyjnego i LC-MS jest skorelowane na rycinie 10. Stężenie hydroksyproliny w tkance wątroby grupy kontrolnej oceniane metodą znakowania fluorescencyjnego korelowało ze stężeniem uzyskanym metodą LC-MS (r=0,957). Również stężenie hydroksyproliny w tkance wątroby grupy otrzymującej DMN metodą znakowania fluorescencyjnego korelowało ze stężeniem uzyskanym metodą LC-MS (r=0,981).

Dyskusja

Hydroksyprolina jest rodzajem aminokwasu występującego w albumenie. Reszty proliny w białku są hydroksylowane przez4-monooxgenazę w celu wytworzenia kwasu 4-hydroksy-2-oksoglutalowego, który jest przekształcany w alaninę i glicynę poprzez kwas 4-glutaminowy w organizmie człowieka. W każdym narządzie wewnętrznym organizmu zapalenie i zwłóknienie może prowadzić do nagromadzenia składników macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) (12).Jednak w warunkach patologicznych dodatkowe zwłóknienie może wystąpić w wątrobie, płucach i nerkach (13,14).Przewlekłe zapalenie wątroby i stwardnienie wątroby są związane z włóknieniem i wykazują ścisłą korelację z rakiem wątroby (15).

W płucach nasilenie włóknienia zależy od rodzaju zapalenia płuc (16).Zazwyczaj włóknienie płuc towarzyszy śródmiąższowemu zapaleniu płuc(17). Włóknienie w narządach wewnętrznych jest spowodowane proliferacją składników ECM odkładanych przez fibroblasty. Zrozumienie rozwoju włóknienia wymaga zbadania stężenia kolagenu. Stężenie hydroksyproliny jest związane z kolagenem jako wskaźnik stopnia zaawansowania włóknienia (18-20). Hydroksyprolina jest ważna jako wskaźnik choroby spowodowanej przez proliferację kolagenu (jak włóknienie) i nieprawidłowe funkcjonowanie metabolizmu.

W ostatnich latach wykazano, że LC-MS jest bardzo czułą metodą detekcji (7,8,21).LC-MS składa się z części LC i MS oraz interfejsu, który je łączy. Część LC jest identyczna do konwencjonalnej HPLC. Próbka jest jonizowana przez sekcję interfejsu. Jonizacja termosprayowa powodowała powstawanie niestabilnych (lotnych) produktów, dlatego zastosowano jonizację APCI (która jonizuje materiał, ale nie rozpuszczalnik, po nebulizacji z rozpuszczalnikiem pod ciśnieniem atmosferycznym). Jonizacja elektrospray (ESI) może być używana do jonizacji cząsteczek o wysokiej polarności i dużej masie cząsteczkowej, co idealnie nadaje się do składnika interfejsu.Jednakże, w obecnym badaniu, ESI nie był dostosowany do pomiaru hydroksyproliny w próbkach ciała, ponieważ ESI nie towarzyszył termospray w przypadku jonizacji. Prostszą procedurą było zmierzenie hydroksyproliny w połączeniu z Na+ przez dodanie dodatkowego Na+ do próbki.

Widmo MS hydroksyproliny wykazało piki m/z 173.0 i 131.15. m/z 173.0 został zidentyfikowany jako pik reprezentujący sól kwasu octowego pochodzącą z amonu kwasu octowego, który został dodany do fazy ruchomej w celu zwiększenia siły jonowej. Ponadto, ze względu na siłę porównawczą m/z 131.15 i 173.0, które są w przybliżeniu identyczne w widmie MS, jon m/z 173.0 został wybrany przez SIM w chromatogramie MS w celu uniknięcia piku zakłócającego fazy ruchomej.

W chromatogramie MS wzorca hydroksyproliny przy 1 ng/ml, w pomiarze SIM zaobserwowano pik z m/z 173.0. W widmie UV (230 nm) hydroksyproliny przy stężeniu 1 μg/ml, które było 1000 razy większe od stężenia standardowego, zaobserwowano mały pik (pomiar został przeprowadzony w tym samym czasie co pomiar LC).

Przy stężeniach <35 ng/ml, wśród obszarów piku, nie zaobserwowano silnej korelacji między różnymi metodami i nie było możliwe stworzenie krzywej standardowej. Wysunięto hipotezę, że na analit mógł mieć wpływ pik fazy ruchomej, ponieważ hydroksyprolina ma stosunkowo małą masę cząsteczkową (131,15). Ponadto, czas retencji piku mógł stać się niestabilny z powodu polarności rozpuszczalnika przy niskich stężeniach (stężenie hydroksyproliny <35 ng/ml).

Postawiono hipotezę, że może być możliwy pomiar stężeń substancji tak niskich jak poziom pg/ml. Dla piku hydroksyproliny w chromatogramie MS czas retencji był krótki (2,213 min). Zdolność hydroksyproliny do zatrzymania na kolumnie ODS była słabsza niż pierwotnie proponowano. Względna siła jonów w widmie MS przy m/z 131,15 i 173,0 była w przybliżeniu identyczna, i odpowiednio, pik interferencyjny fazy ruchomej wybrał jon m/z 173,0. W chromatogramie LC-MS hydroksyproliny w płucach i tkance wątroby, ostry pik m/z 173.0 był obserwowany przy czasie retencji 2,213 min, tak jak dla standardu hydroksyproliny. W odniesieniu do widma MS, pik jonu molekularnego hydroksyproliny (m/z 131.15) został potwierdzony.

Pomiar stężenia hydroksyproliny w tkankach płuc i wątroby metodą LC-MS został porównany z tym uzyskanym metodą kolorymetryczną, jak również metodą fluorescencyjną przy użyciu HPLC z poprzedniego badania przez naszą grupę. Stwierdzono wysoce istotną dodatnią korelację. Jednakże wartość stężenia hydroksyproliny w płucach uzyskana metodą kolorymetryczną była wyższa niż uzyskana metodą LC-MS. Ponadto wartość stężenia hydroksyproliny w wątrobie uzyskana metodą fluorescencyjną z wykorzystaniem HPLC była niższa w porównaniu z wartością uzyskaną metodą LC-MS (która miała być wysoką absorbancją wszystkich składników w próbce przy stałej długości fali 560 nm).

W podsumowaniu należy stwierdzić, że hydroksyprolina, jako wskaźnik włóknienia, była mierzona metodami kolorymetrycznymi i HPLC w poprzednich badaniach naszej grupy. Dla porównania, w obecnym badaniu stwierdzono, że korzystniejsza jest metoda LC-MS, która charakteryzuje się prostotą procesu, wysoką czułością (poziom pg) i krótkim czasem rozdzielania. Further investigations with larger sample sizes are warranted to confirm these results.

Acknowledgements

The authors are grateful to M. Kusunose, M. Ono andA. Hamada (Department of Pharmacy, Kochi Medical School, Kochi, Japonia) za dostarczenie kilku odczynników użytych w tym badaniu, pomocne sugestie i ekspertyzy techniczne. This work was funded by thePublic Health Department of Heilongjiang Province (no. 2013365) ofChina.

	Kitchener RL and Grunden AM: Prolidasefunction in proline metabolism and its medical and biotechnologicalapplications. J Appl Microbiol. 113:233-247. 2012. Wyświetl artykuł : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Myllyharju J: Prolyl 4-hydroxylases, keyenzymes in the synthesis of collagens and regulation of theresponse to hypoxia, and their roles as treatment targets. Ann Med.40:402-417. 2008. View Article : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Wick G, Grundtman C, Mayerl C, et al: Theimmunology of fibrosis. Annu Rev Immunol. 31:107-135. 2013.View Article : Google Scholar
	Hofman K, Hall B, Cleaver H and MarshallS: High-throughput quantification of hydroxyproline fordetermination of collagen. Anal Biochem. 417:289-291. 2011.View Article : Google Scholar : PubMed/NCBI
	McAnulty RJ: Methods for measuringhydroxyproline and estimating in vivo rates of collagen synthesisand degradation. Methods Mol Med. 117:189-207. 2005.PubMed/NCBI
	McCooeye M and Mester Z: Comparison offlow injection analysis electrospray mass spectrometry and tandemmass spectrometry and electrospray high-field asymmetric waveformion mobility mass spectrometry and tandem mass spectrometry for thedetermination of underivatized amino acids. Rapid Commun MassSpectrom. 20:1801-1808. 2006. ViewArticle : Google Scholar
	Jemal M and Xia YQ: LC-MS Developmentstrategies for quantitative bioanalysis. Curr Drug Metab.7:491-502. 2006. View Article : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Chen G and Pramanik BN: LC-MS for proteincharacterization: current capabilities and future trends. ExpertRev Proteomics. 5:435-444. 2008. View Article : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Becker S, Kortz L, Helmschrodt C, et al:LC-MS-based metabolomics in the clinical laboratory. J Chromatogr BAnalyt Technol Biomed Life Sci. 883-884:68-75. 2012.
	Cui T, Kusunose M, Hamada A, et al:Relationship between the eosinophilia of bronchoalveolar lavagefluid (BALF) and the severity of pulmonary fibrosis induced bybleomycin in rats. Biol Pharm Bull. 26:959-963. 2003. View Article : Google Scholar
	Kusunose M, Qiu B, Cui T, Hamada A, et al:Effect of Sho-saiko-to extract on hepatic inflammation and fibrosisin dimethylnitrosamine induced liver injury rats. Biol Pharm Bull.25:1417-1421. 2002. View Article : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Maruyama K: Hydroxproline. Nihon Rinsho.62(Suppl 12): 220-223. 2004.(In Japanese).
	Muiznieks LD and Keeley FW: Molecularassembly and mechanical properties of the extracellular matrix: Afibrous protein perspective. Biochim Biophys Acta. 1832:866-875.2013. View Article : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Lu P, Takai K, Weaver VM and Werb Z:Extracellular matrix degradation and remodeling in development anddisease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3:a0050582011.PubMed/NCBI
	Pungpapong S, Kim WR and Poterucha JJ:Natural history of hepatitis B virus infection: an update forclinicians. Mayo Clin Proc. 82:967-975. 2007. View Article : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Strieter RM and Mehrad B: New mechanismsof pulmonary fibrosis. Chest. 136:1364-1370. 2009. View Article : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Swigris JJ i Brown KK: Acute interstitial pneumonia and acute exacerbations of idiopathicpulmonary fibrosis. Semin Respir Crit Care Med. 27:659-267. 2006.View Article : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Ono M, Miyamura M, Kyotani S, et al:Effects of Sho-saiko-to extract on liver fibrosis in relation tothe changes in hydroxyproline and retinoid levels of the liver inrats. J Pharm Pharmacol. 51:1079-1084. 1999. View Article : Google Scholar
	Ono M, Miyamura M, Kyotani S, et al:Effect of Sho-saiko-to extract on HGF and TGF-beta levels ofintraorgans in liver-injured rats after partial hepatectomy. JPharm Pharmacol. 52:111-118. 2000. View Article : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Kusunose M, Qiu B, Cui T, et al: Effect ofSho-saiko-to extract on hepatic inflammation and fibrosis indimethylnitrosamine induced liver injury rats. Biol Pharm Bull.25:1417-1421. 2002. View Article : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Holčapek M, Jirásko R and Lísa M: Recentdevelopments in liquid chromatography-mass spectrometry and relatedtechniques. J Chromatogr A. 1259:3-15. 2012.