Zatrudniliśmy źródła odżywcze glukozy, glukozy i glutaminy, aby rozszyfrować przepływ węgla w komórkach K562 i zmiany w odpowiedzi na leczenie BaP. Ogólnie rzecz biorąc, obserwujemy największą ilość inkorporacji etykiety do cząsteczek rybozy i mleczanu (patrz i plik dodatkowy 1: Rysunek S1 dla szczegółów dotyczących dystrybucji etykiet). Jak pokazano na Rys. 1, można oczekiwać, że włączenie etykiety do cyklu Krebsa powstającego z glukozy spowoduje dwa wyraźnie różne wzory znakowania metabolitów cyklu Krebsa w zależności od tego, czy fragment C2 wchodzi przez karboksylazę pirogronianową (PC) czy dehydrogenazę pirogronianową (PDH). Z pirogronianu powstałego z glukozy powstanie glutaminian poprzez PDH, ale glutaminian poprzez aktywność PC. Ponieważ aktywność PC wytwarza oksalooctan z pirogronianu, można spodziewać się jabłczanu pochodzącego z PC, podczas gdy produktem PDH będzie jabłczan lub jabłczan.

Widma NMR wskazują, że duże ilości asparaginianu i jabłczanu pochodzą z PC

Jak pokazano na Rys. 2, obserwuje się istotne różnice pomiędzy komórkami przetwarzającymi glukozę przez 3 vs. 24 h dla rezonansów jabłczanu i asparaginianu. Różnice te przejawiają się przede wszystkim w zmianie stałych sprzężenia NMR. Wielkość tych stałych sprzężenia zależy od charakteru przylegającego atomu węgla: grupa kwasu karboksylowego daje znacznie większą stałą sprzężenia niż grupa CH2. Stała sprzężenia dla cząsteczki 13C1 13C2 w asparaginianach lub jabłczanach wynosi około 50-60 Hz, podczas gdy stała sprzężenia dla cząsteczki 13C2 13C3 wynosi około 35-40 Hz.

Dla 24-h okresu znakowania, Rys. 2 pokazuje pozorne stałe sprzężenia 53 Hz dla C2 jabłczanu i asparaginianu. Ta duża pozorna stała sprzężenia wskazuje, że dominuje sprzężenie C2 z sąsiadującą grupą kwasu karboksylowego C1. Ten wzór sprzężenia 13C1 13C2 (a także 13C3 13C4, patrz plik dodatkowy 1) wynika z aktywności PDH i być może również z metabolitów przechodzących wielokrotnie przez cykl Krebsa przy dłuższym okresie znakowania.

Dla krótkiego 3-h okresu znakowania obserwuje się mniejsze pozorne stałe sprzężenia 47 i 41 Hz dla C2 (ryc. 2 i plik dodatkowy 1: rysunek S1), wskazując, że dominuje sprzężenie z sąsiadującym metylenem C3. Obecność cząsteczki 13C2 13C3 przy krótszych okresach znakowania wskazuje, że produkt powstający w wyniku aktywności PC dominuje dla krótszych okresów znakowania.

Należy zauważyć, że obserwowane podziały sygnałów nie reprezentują dokładnych skalarnych stałych sprzężenia w mieszaninie znakowanych związków. Niemniej jednak obserwowana zmiana stanowi wyraźne wskazanie na większe ilości produktu PC przy krótszych okresach znakowania zarówno w jabłczanie jak i asparaginianach.

Dalsze dowody na aktywność PC w podspektrach uracylu

W syntezie pirymidyn de novo, uracyl powstaje z asparaginianu poprzez karbamoilo-asparaginian, orotan i dihydroorotan. Dlatego wzorce znakowania w asparaginianach powinny być odzwierciedlone w sygnałach pierścieni pirymidynowych. Plik dodatkowy 2: Rysunek S2 przedstawia oczekiwane inkorporacje etykiet dla uracylu. Kiedy baza uracylowa w UDP jest syntetyzowana z asparaginianu, przeznaczenie 13Cs jest następujące: C1, C2 i C3 asparaginianu stają się odpowiednio C10, C11 i C12 UDP, podczas gdy C4 jest tracony (patrz plik dodatkowy 2). W widmach HSQC, tylko C11 i C12 są w stanie być bezpośrednio obserwowane, ponieważ C10 nie ma dołączonego protonu.

Dla próbek znakowanych glukozą, asparaginian pochodzący z PC będzie znakowany C2C3. Jest to przekształcane do znakowanego fragmentu C11C12 w UDP. Jednakże asparaginian pochodzący z PDH może być znakowany w C1C2 lub C3C4. Przekłada się to odpowiednio na C10C11 lub izolowany C12 w uracylu. Dlatego widma C12 wskazują na względne ilości PC vs. aktywność PDH; PC daje dublet dla C12, podczas gdy PDH daje singlet przy C12.

Wszystkie widma wykazywały zarówno sygnał singletowy jak i dubletowy przy C12 (Rys. 3). Jednakże intensywność dubletów w stosunku do singletów zmieniła się pomiędzy danymi z 3 i 24 h o czynnik trzykrotny, ponownie wskazując na przejście z PC na znakowanie PDH w czasie. Obraz, który wyłania się z kilku metabolitów jest taki, że istnieje równoległa aktywność zarówno PC jak i PDH, ale produkt PC jest głównie kierowany do produktów bezpośrednio związanych z oksalooctanem, co daje wysoką obserwowaną ilość produktu PC w tych metabolitach w krótkotrwałej ekspozycji. Dopiero przy dłuższych okresach znakowania obserwuje się produkt PDH w lewej gałęzi cyklu Krebsa.

Malonian indukowany przez BaP-malonian indukowany BaP pochodzi z aktywności PC downstream w komórkach K562

Wykazaliśmy, że malonian może być tworzony z oksalooctanu przez konwersję chemiczną pod wpływem nadtlenku wodoru i zasugerowaliśmy w naszym poprzednim badaniu, że akumulacja malonianu w odpowiedzi na traktowanie BaP była napędzana przez indukowane traktowaniem podniesienie ROS działające na oksalooctan. Próbki zostały spiked z malonianem, aby potwierdzić nasze przypisanie malonianu metylenowych rezonansów 1H/13C w widmach HSQC (patrz pliki dodatkowe 3 i 4). Następnie, w tym badaniu, nasze podejście oparte na znacznikach pozwoliło nam rozważyć pochodzenie obserwowanego malonianu.

Jak pokazano na ryc. 4a, malonian pochodzący z ROS, powstający z oksalooctanu, który został utworzony bezpośrednio z pirogronianu przez aktywność PC przy użyciu glukozy jako źródła składników odżywczych, powinien być znakowany w pozycjach C1 i C2. W alternatywnej sytuacji, w której aktywność PDH przekształca pirogronian w acetylo-CoA po wejściu do cyklu Krebsa, należałoby się spodziewać, że przekształcenie powstałego w ten sposób oksalooctanu w malonian z udziałem ROS da początek dwóm produktom z etykietą w pozycji C1 lub w pozycjach C1 i C2 w stosunku 1:1, ponieważ cykl Krebsa przechodzi przez symetryczny bursztynian i fumaran (zob. również rys. 1).

Rysunek 4b przedstawia reprezentatywny wycinek 1D z widm HSQC pochodzących z komórek znakowanych glukozą poddanych 24 h działaniu BaP i wyraźnie demonstruje indukowane lekiem generowanie silnego sygnału malonianu. W odpowiednich widmach HSQC pochodzących z komórek znakowanych glukozą przez 24 h BaP, zaobserwowaliśmy wyraźny dublet (Rys. 4c pokazany jako czerwone piki) z rozszczepieniem 58 Hz, wskazujący na znakowaną grupę CH2 sprzężoną z węglem kwasu karboksylowego. Jest to wyraźne wskazanie na malonian znakowany C1,C2 (lub C2,C3) z etykietą tylko w jednej z dwóch grup kwasu karboksylowego. Malonian znakowany we wszystkich trzech pozycjach, które mogą powstać w wyniku wielokrotnego przejścia przez cykl Krebsa, powinien wykazywać tryplet przy C2 w wymiarze 13C widm HSQC, ponieważ przynajmniej pewien procent byłby znakowany w obu grupach COO (wzór sprzężenia AX2). Dlatego brak centralnego sygnału w HSQC jest wysoce wskazujący na to, że malonian pochodzi z aktywności PC. Brak malonianu pochodzącego z wielokrotnych cykli Krebsa i aktywności PDH jest również poparty faktem, że malonian powstający w wyniku 24-godzinnego znakowania komórek poddanych działaniu BaP glukozy wykazywał jedynie singlet (Rys. 4c pokazany jako niebieski pik).

W celu dalszego udowodnienia, że malonian indukowany lekami pochodzi z aktywności PC, uzyskaliśmy widma 13C-1D, w których mogliśmy bezpośrednio obserwować rezonanse COO malonianu (Rys. 4d). Widmo referencyjne 10 mM kwasu malonowego w tym samym buforze (pH 7), który został użyty do ekstraktów komórkowych, potwierdziło częstotliwość rezonansu COO (Rys. 4d).

Oczekuje się, że znakowanie z udziałem PC da dublet przy C1 (pochodzący od malonianu), podczas gdy znakowanie z udziałem PDH da mieszaninę 50:50 dubletów pochodzących od malonianu i singletów pochodzących od malonianu (Rys. 4a). Chociaż widmo było zaszumione nawet po 24 godzinach akwizycji, uzyskane widma wykazały wyraźny dublet bez resztkowego sygnału w środku (Rys. 4d), potwierdzając, że produkt znakowania pochodzący z PC jest dominujący. Na tej podstawie wnioskujemy, że malonian rzeczywiście pochodzi z pośredniczonej przez ROS konwersji oksalooctanu pochodzącego całkowicie lub przynajmniej w przeważającej mierze z aktywności PC i nie wykazuje żadnego wkładu z możliwego produktu PDH nawet po 24-godzinnym okresie znakowania. Eksperymenty kontrolne z użyciem glutaminy jako źródła węgla wykazały jedynie minimalną inkorporację etykiety do malonianu. Wykazano, że malonian produkowany z glukozy jest w przeważającej mierze znakowany przez PC. Łącznie te dwa fakty silnie sugerują, że malonian jest produkowany głównie z glukozy poprzez glikolizę i pośredniczące w PC wprowadzanie pirogronianu do cyklu TCA.

Dowody równoległej aktywności PDH

Tabela 1 porównuje stałe sprzężenia 1 J CC i wzory intensywności multipletów widziane w zestawach danych znakowanych 3 i 24 h. Zarówno w 3 jak i 24-godzinnych zestawach danych, znakowanie przy C4 glutaminianu jest znacznie większe niż znakowanie przy C4, a rozszczepienie widoczne przy C4 wskazuje na sprzężenie z C5. To silnie sugeruje, że znakowanie wspomagane przez PDH jest dominujące dla glutaminianu w obu punktach czasowych. Cytrynian C2 jest rozdzielony przez duże sprzężenie z C1, ponownie silnie sugerując, że znakowanie PDH jest dominujące. Te wzory znakowania wskazują na wyraźną dominację produktów PDH dla prawej gałęzi cyklu Krebsa, prowadzącej od cytrynianu do glutaminianu.

Komputerowa analiza multipletów

Skrawki z 1H-13C-HSQC były również analizowane ilościowo poprzez symulację widm 13C-NMR dla mieszaniny różnych izotopomerów przy użyciu oprogramowania pyGamma z poziomu oprogramowania NMRLab . W przypadku glutaminianu, analiza multipletów potwierdziła, że znakowanie PDH było dominujące zarówno po 3 jak i 24 godzinach, niezależnie od traktowania BaP. W przypadku asparaginianu analiza multipletów potwierdziła, że nastąpiło przejście od znakowania z udziałem PC w 3 h do znakowania z udziałem PDH w 24 h. Symulowane widma pokazano w pliku dodatkowym 5: Rysunek S4, a Tabela 2 potwierdza wyniki jakościowe dla asparaginianu i glutaminianu.

.