W 1440 r. włoski ksiądz, humanista, retor i orator Lorenzo Valla rozpowszechnił w rękopisie De falso credita et ementita Constantini Donatione declamatio, dowodząc na gruncie historycznym i językowym, że Donacja Konstantyna była falsyfikatem. Ze względu na sprzeciw Kościoła esej ukazał się drukiem dopiero w wydaniu Ulricha von Huttena w 1517 roku. Stał się on popularny wśród protestantów, a angielskie tłumaczenie zostało opublikowane dla Thomasa Cromwella w 1534 roku. Valla argumentował swoją tezę tak przekonująco, że jest ona aktualna do dziś, a nielegalność Donacji Konstantyna jest powszechnie uznawana.

Valla wykazał, że dokument nie mógł być napisany w historycznej epoce Konstantyna I (IV wiek), ponieważ jego wernakularny styl datował się ostatecznie na późniejszą epokę (VIII wiek). Jednym z powodów Valla było to, że dokument zawierał słowo satrapa, którego, jak wierzył, Rzymianie tacy jak Konstantyn I nie użyliby.

Chociaż początkowo spotkał się z wielką krytyką, Donacja Konstantyna została przyjęta jako prawomocna, zwłaszcza ze względu na korzystny charakter jej treści dla zachodniego kościoła. Donacja Konstantyna sugerowała, że Konstantyn I „podarował” całe Cesarstwo Zachodniorzymskie Kościołowi Rzymskiemu w akcie wdzięczności za cudowne wyleczenie z trądu przez papieża Sylwestra I. To oczywiście zdyskontowałoby własną Donację Pepina Krótkiego, która dała Lombardom ziemie na północ od Rzymu.

„Valla został zmotywowany do ujawnienia Donacji Konstantyna jako oszustwa przez swojego ówczesnego pracodawcę, Alfonsa Aragońskiego, który był zaangażowany w konflikt terytorialny z państwami papieskimi, wówczas pod rządami papieża Eugeniusza IV. Donacja Konstantyna była często przywoływana na poparcie doczesnej władzy papiestwa, przynajmniej od XI wieku” (artykuł w Wikipedii o Lorenzo Valli, dostęp 01-17-2009).