2.2 Production Strategies for Levan

Lewan jest syntetyzowany jako egzopolisacharyd (EPS) w macierzy zewnątrzkomórkowej bakterii z różnych rodzajów, takich jak Acetobacter, Aerobacter, Azotobacter, Bacillus, Corynebacterium, Erwinia, Gluconobacter, Mycobacterium, Pseudomonas, Streptococcus i Zymomonas (Sarilmiser i in., 2015). Oprócz tych ekstremofilnych producentów lewanu, Poli i wsp. (2009) podali Halomonas sp. jako producenta lewanu. Dalsze badania dotyczyły potencjalnego zastosowania Halomonas levan jako czynnika bioflokulacyjnego (Sam i in., 2011), peptydowego i białkowego systemu dostarczania leków (Sezer i in., 2011, 2015), biokompatybilnej cienkiej (Sima i in., 2011, 2014), adhezyjnej folii wielowarstwowej (Costa i in., 2013) oraz glikanu naśladującego heparynę (Erginer i in., 2016). Rys. 12.2 przedstawia ogólny proces produkcji mikrobiologicznego lewanu.

Figure 12.2. Podstawowe etapy przetwarzania lewanu.

Mikrobiologiczne EPS są zwykle produkowane w tlenowych, zanurzonych systemach fermentacyjnych. Warunki fermentacji, takie jak napowietrzanie, mieszanie, pH, stężenie rozpuszczonego tlenu, temperatura, skład pożywki i konstrukcja bioreaktora mogą określać właściwości produktu i wydajność produkcji. W związku z tym, aby osiągnąć wysoką jakość produkcji i wydajność, należy przeprowadzić szczegółową optymalizację tych parametrów dla każdego organizmu (Öner i in., 2016). Na przykład, Srikanth i wsp. (2015) badali wpływ parametrów fermentacji, w tym początkowego pH, dodatku lewanu, stężenia sacharozy, źródła azotu, stężenia inokulum i czasu hodowli na syntezę lewanu przy użyciu Acetobacter xylinum NCIM2526 jako szczepu producenckiego. Optymalne warunki określono na 10, 50-60 i 1.49 g/L odpowiednio dla azotu, sacharozy i inokulum. Wydajność produkcji lewanu wyraźnie wzrosła po pierwszych 24 h, a maksymalną wydajność lewanu uzyskano po 122 h, gdy początkowe pH ustalono na poziomie 6,8. Zwiększenie początkowego dodatku lewanu z 0,1 do 0,4 g/L zwiększyło wydajność lewanu z 1,22 do 1,65 g/L; powyżej 0,4 g/L nie obserwowano dalszego wzrostu wydajności. Stężenia inokulum od 5% (v/v) do 10% (v/v) spowodowały zmianę wydajności lewkonii zgodnie z oczekiwaniami, a maksymalną wydajność (1,46 g/L) uzyskano przy stężeniu 7% (v/v). Stężenia sacharozy od 20 do 80 g/L wpływały na wydajność lewanu. W zakresie 40-50 g/L wydajność produkcji była zwiększona, w zakresie 70-80 g/L była zmniejszona, a w zakresie 20-40 g/L nie uległa zmianie.

Sarilmiser i wsp. (2015) badali produkcję lewanu w halofilnym mikroorganizmie (Halomonas smyrnensis AAD6T) stosując różne czynniki stymulujące. Na przykład, zastosowano różne strategie karmienia w różnych odstępach czasu w systemie bioreaktora wsadowego, a także przetestowano wiele warunków początkowych w hodowlach wstrząsanych. Spośród testowanych różnych pH i stężeń sacharozy, maksymalną wydajność lewanu osiągnięto przy pH 7 (1.345 g/L lewanu) i 50 g/L sacharozy (1.320 g/L lewanu). W przypadku zastosowania ograniczeń azotowych i fosforowych zarówno stężenie lewanu, jak i biomasa uległy obniżeniu, natomiast wartości Yp/x wzrosły. Strategie impulsów azotowych zmniejszały syntezę lewanu ze względu na wydłużony okres wzrostu, strategie impulsów sacharozowych znacząco poprawiały wzrost komórek i produkcję lewanu, a impulsy NaCl nie miały wpływu na wzrost. Co ciekawe, kultury hodowane w obecności kwasu borowego produkowały najwyższe stężenia lewanu (8,84 g/L) w kontrolowanych warunkach bioreaktora. Ta poprawa została wyjaśniona przez biologiczne zjawisko znane jako quorum sensing (QS), w którym zaangażowane są atomy boru; jedna z cząsteczek sygnalizacyjnych zaangażowanych w QS w H. smyrnensis AAD6T została później zidentyfikowana jako C16-acylhomoserinelakton (Abbamondi et al., 2016).

Ciężar cząsteczkowy lewanu jest czynnikiem decydującym o możliwości jego zastosowania w różnych gałęziach przemysłu, w tym w przemyśle spożywczym, kosmetycznym i medycznym (Belghith et al., 1996). Określenie optymalnych warunków produkcji lewanu jest kluczowe dla uzyskania pożądanego związku o masie cząsteczkowej (Porras-Domínguez et al., 2015). Na przykład, Wu i wsp. (2013) oceniali subtelne modyfikacje procesu produkcyjnego w celu uzyskania różnych mas cząsteczkowych lewanu w systemach wsadowych i podawczych, używając Bacillus subtilis (natto) Takahashi jako szczepu producenckiego. Gdy zastosowano wysokie (400 g/L) i niskie (20 g/L) stężenie sacharozy, uzyskano odpowiednio niższą i wyższą masę cząsteczkową lewanu. Ta liniowa zależność została przypisana wpływowi sacharozy na enzym lewansukrazę. Autorzy doszli do wniosku, że masa cząsteczkowa lewanu zależy od warunków reakcji, takich jak pH, temperatura, szybkość mieszania i sacharoza, przy czym ta ostatnia jest najskuteczniejszym czynnikiem determinującym masę cząsteczkową lewanu.

Produkcja lewanu w unieruchomionych systemach komórkowych jest również korzystna, ponieważ takie systemy korzystają ze stosunkowo łatwych procesów dalszych, wysokiej wydajności objętościowej, zaawansowanej kontroli procesu i zmniejszonego ryzyka zanieczyszczenia w produkcji EPS (Ürküt i in., 2007). Wdrożenie tej korzystnej metody do produkcji lewanu może być wykorzystane jako alternatywa dla procesów wsadowych, wsadowo-odbiorczych i ciągłych (Öner i in., 2016). Na przykład, Silbir i wsp. (2014) badali produkcję lewanu w systemach fermentacji okresowej i ciągłej przy użyciu Zymomonas mobilis B-14023. Ciągłą fermentację prowadzono w bioreaktorze typu „packed-bed” z wykorzystaniem komórek unieruchomionych w Ca-alginianie. Czas inkubacji, początkowe pH i stężenie substratu były trzema najistotniejszymi zmiennymi procesowymi dla produkcji lewanu w systemie wsadowym. Największą ilość lewanu (40,2 g/L) wyprodukowano, gdy jako źródło azotu organicznego w hodowli w kolbach wstrząsanych zastosowano ekstrakt drożdżowy. Ponadto, do produkcji lewanu z powodzeniem zastosowano immobilizowane komórki Z. mobilis w układzie fermentacji ciągłej. Niekontrolowane spadki ciśnienia w układzie i rozpad kulek żelu Ca-alginianowego były głównymi ograniczeniami dla dłuższych czasów fermentacji.

Mimo różnorodności mikroorganizmów wytwarzających lewan, koszty produkcji polisacharydu lewanu pozostają wysokie. Jest to prawdopodobnie największe wąskie gardło w jego komercjalizacji (Öner i in., 2016; Sarilmiser i in., 2015). Pożywki fermentacyjne stanowią około 50% kosztów produkcji w procesie mikrobiologicznym (Van Hoek i in., 2003); jednak niedrogie źródła węgla, takie jak syropy i melasa były wcześniej wykorzystywane do mikrobiologicznej produkcji lewanu (Özcan i Öner, 2015). Kucukasik i wsp. (2011) badali melasę z buraków cukrowych i melasę skrobiową jako substytuty sacharozy w kulturach Halomonas. Klarowanie, pH, kwas siarkowy, fosforan trójwapniowy i węgiel aktywny były stosowane w różnych kombinacjach w celu dostosowania dostępności chemicznej do produkcji lewanu. Stwierdzono, że maksymalna wydajność lewanu została osiągnięta przy stężeniu 10 g/L TCPHAC i wynosi odpowiednio 4,19 i 3,68 g/L. Przy zastosowaniu 30 g/L TCPHAC i HAC uzyskano wydajność lewanu wynoszącą 7,56 i 4,44 g/L. Usunięcie metali ciężkich i zwiększenie stężenia żelaza spowodowało spadek integralności komórek i wydajności lewanu w tym badaniu. W innych badaniach, melasa z trzciny cukrowej blackstrap w kulturach Bacillus lentus V8 (Abou-Taleb i in., 2015), syrop daktylowy w kulturach Mycobacterium levaniformis 1406 (Moosavi-Nasab i in., 2010), melasa z buraka cukrowego w kulturach Paenibacillus polymyxa NRRL B-18475 (Han i Watson, 1992) oraz melasa i syrop z trzciny cukrowej w kulturach Z. mobilis ATCC 31821 (De Oliveira i in., 2007) były badane jako tanie źródła węgla do produkcji lewanu.

Biosynteza lewanu w zanurzonych systemach fermentacyjnych jest ograniczona przez wymóg wzrostu komórkowego, który może nie spełniać optymalnych warunków dla wysokiej aktywności lewanu (Santos-Moriano et al., 2015). Jednakże systemy bezkomórkowe usuwają to ograniczenie i zapewniają dodatkowe korzyści, takie jak łatwe przygotowanie, możliwość wielokrotnego użycia i kontrola zmian mikrośrodowiska (Jang i in., 2001). Z tego powodu, zapewnienie optymalnego środowiska dla lewansukraz jest kluczowe. Na przykład, Lu i wsp. (2014) badali wpływ różnych czynników, takich jak stężenie substratu, czas reakcji, temperatura i pH na produkcję lewanu przy użyciu rekombinowanej lewansukrazy w systemie bezkomórkowym. Zaobserwowali maksymalną wydajność lewanu (7,1 g/L) przy użyciu 0,8 M sacharozy, pH 6,5 i 40°C przez 24 h. Wydajność lewanu wzrastała równolegle ze wzrostem stężenia sacharozy od 0 do 0,8 M. Ich badania wykazały, że rekombinowany enzym wykazuje podobne właściwości biochemiczne do enzymu natywnego.

.