Biological Assays of Bradykinin and Related Kinins
Kininy są silnymi środkami hipotensyjnymi u wszystkich badanych gatunków zwierząt (54). Najbardziej powszechnym testem in vivo dla tych peptydów jest badanie ciśnienia krwi u szczurów, opisane wcześniej. Efekty wazodylatacyjne kinin są mierzone w izolowanych perfundowanych narządach z nienaruszonym śródbłonkiem, zgodnie z procedurą opisaną w sekcji IV. Efekt relaksacyjny kinin w naczyniach tętniczych jest oceniany in vitro w tętnicy szyjnej psa (57) przy użyciu metody opisanej przez Regoli i Barabé (34). Efekt wenokonstrykcyjny jest mierzony in vitro w żyle szyjnej królika (42), zgodnie z procedurą opisaną poniżej.
Żyłki, pobrane od królików (1,0-2,0 kg), są cięte na helikoidalne paski o szerokości 2 mm i długości 2 cm i zawieszane w roztworze Krebsa (natlenionym w 37°C) zawierającym inhibitor enzymu konwertującego (Captopril, 10 μM), aby zapobiec degradacji kinin (34). Skurcze tkanki w odpowiedzi na kininy są rejestrowane w sposób opisany wcześniej, a pełne krzywe stężenie-odpowiedź są zwykle mierzone w celu oceny powinowactwa kinin i ich antagonistów. Wykazano, że żyła szyjna królika zawiera podtyp receptora B2 (B2A) (Tabela V).
Najczęściej stosowanym preparatem nienaczyniowym jest jelito kręte świnki morskiej, które jest pobierane od świnek morskich o wadze 250-350 g i przygotowywane jako podłużny pasek mięśni gładkich, zgodnie z Rang (37). Tkankę zawiesza się in vitro w roztworze Krebsa (natlenionym w temperaturze 37°C), a zmiany jej napięcia mierzy się w sposób opisany powyżej dla izolowanych naczyń (patrz rozdział I). Jelito kręte świnki morskiej jest preparatem używanym do scharakteryzowania podtypu receptora B2B (Tabela V).
Receptory B1 są badane przy użyciu paska aorty królika, przygotowanego i traktowanego w taki sam sposób jak w przypadku angiotensyny. Tkanka jest prawie niewrażliwa na kininy, zwłaszcza na desArg9BK, agonistę receptorów Bt, na początku doświadczenia. Wrażliwość tkanki wzrasta w ciągu kilku godzin (do 6-10 godz.) inkubacji, ponieważ receptory B1 są tworzone de novo (55). Efekty kurczliwości kinin są rejestrowane i analizowane przy użyciu tych samych instrumentów i metod opisanych w sekcji I dla angiotensyny. Tkanki królika mogą być uwrażliwione na desArg9BK przez wstępne traktowanie zwierząt lipopolisacharydem (LPS), który jest wstrzykiwany dożylnie 5 godzin przed zabiciem zwierzęcia (56). Mechanizm generowania receptorów B1 przez LPS został zbadany (60, 61). Aorty i inne tkanki pobrane od królików leczonych LPS reagują na desArg9BK od początku inkubacji in vitro (56). Podobnie tętnice nerkowe psów ulegają spontanicznej ekspresji receptorów B1 i wykazują wysoką wrażliwość na desArg9BK (62).
Do scharakteryzowania receptorów kininowych w izolowanych narządach użyto kilku związków, wykorzystując odpowiedzi biologiczne (kurczliwe) trzech preparatów (tab. V). Bradykininy i kallidyna są silnymi stymulantami żyły szyjnej królika (RJV) i jelita krętego świnki morskiej (GPI), podczas gdy desArg9BK i Lys,desArg9BK są nieaktywne. Odwrotna kolejność potencji jest obserwowana w aorcie królika (RA). desArg9BK jest antagonistą tylko na RA. Na tej podstawie Regoli i Barabé (54) zaproponowali hipotezę dwóch receptorów kininowych, B1 (RA) i B2 (RJV, GPI, i wiele innych preparatów i testów), który został scharakteryzowany początkowo tylko z agonistami (54), a następnie (patrz poniżej) został scharakteryzowany z antagonistami. Antagoniści receptora B2 zostali zidentyfikowani przez Vavrek i Stewart (63), a następnie udoskonaleni przez różnych badaczy (64-66) przez zastąpienie Pro3 przez hydroksyprolinę (Hyp), przez dodanie d-Arg do N-końca, przez zastąpienie Phe8 przez Leu, oraz przez zastąpienie dipeptydu Pro7-Phe8 przez d-Tic-Oic (67-69). Prototyp każdej serii antagonistów jest przedstawiony w Tabeli V, aby wskazać, że b-2-tienylo-elanina (Thi) nie jest potrzebna w pozycjach 5 i 9, podczas gdy Hyp3 i d-Arg0 są ważne dla powinowactwa, szczególnie na RJV. Podstawienie Phe8 przez Leu, dodane do pozostałych modyfikacji, prowadzi do powstania d-ArgBK, który (a) jest prawie pozbawiony aktywności agonistycznej i (b) jest aktywny na RJV, mniej aktywny na GPI i raczej słaby na RA (B1), a więc jest dość selektywny dla miejsca B2. Różnica między wartościami pA2 (o dwie jednostki log) między RJV i GPI jest decydującym odkryciem dla proponowanego (Tabela V) podziału receptorów B2 na B2A (RJV) i B2B (GPI). D-ArgBK jest kompetycyjnym antagonistą, szybko odwracalnym zarówno in vivo, jak i in vitro i różni się od Hoe 140, który jest niekompetycyjny (brak równowagi), prawdopodobnie dlatego, że ma przedłużoną interakcję zarówno z miejscami B2A, jak i B2B (59, 67, 68, 70). Rozróżnienie pomiędzy B2A i B2B potwierdzają wyniki uzyskane z dwoma ostatnimi związkami (Tabela V), które różnią się resztami w trzeciej pozycji. Obecność Hyp sprzyja antagonizmowi (pA2 7,6) na B2A i częściowej aktywności agonistycznej na B2B, natomiast Tyr3 daje silnego agonistę na B2A i dość dobrego antagonistę (czysty antagonista) na B2B. Ta nowa klasyfikacja została przedstawiona w artykule przeglądowym (71). Miejsca funkcjonalne kinin to zatem B, i B2 (rozważane są dwa podtypy). Zaproponowano kilka innych receptorów (B3, B4 i B5) (72-74), ale ich istnienia nie wykazano na podstawie solidnych danych doświadczalnych (patrz krytyczny przegląd w ref. 59). Wywołane przez kininy uwalnianie histaminy z mastocytów otrzewnej szczura jest zjawiskiem nieswoistym, które przypisuje się kationowemu charakterowi kinin (75, 76).
.