Kultury komórkowe i RNAi

Linia komórkowa S2 Drosophila melanogaster (z kolekcji IMG RAS) i linia komórkowa Kc167 (z Drosophila Genomics Resource Center) były hodowane w temperaturze 25 °C w Schneider’s Drosophila Medium (Gibco) uzupełnionym 10% inaktywowanym termicznie płodowym boćkiem.inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS, Gibco), 50 jednostek/ml penicyliny i 50 µg/ml streptomycyny. OSCs47 dostarczone przez M. Siomi były hodowane w podłożu Shields and Sang M3 insect medium (Sigma-Aldrich) uzupełnionym 10% inaktywowanym termicznie FBS (Gibco), 10% ekstraktem z muchy (http://biology.st-andrews.ac.uk/sites/flycell/flyextract.html), 10 µg/ml insuliny (Sigma-Aldrich), 0,6 mg/ml glutationu (Sigma-Aldrich), 50 jednostek/ml penicyliny i 50 µg/ml streptomycyny. dsRNA przeciwko lacZ lub laminowi Dm0 do traktowania RNAi komórek S2 przygotowano zgodnie z wcześniejszym opisem11. dsRNA przeciwko LBR przygotowano w ten sam sposób, używając genomowego DNA Drosophila jako szablonu do amplifikacji PCR i starterów podanych w Tabeli 1. Traktowanie komórek dsRNA przeprowadzono w ciągu czterech dni przy użyciu wcześniej opisanego protokołu48.

Analiza western-blot

Białka ekstrahowano przy użyciu 8 M mocznika, 0,1 M Tris-HCl, pH 7,0, 1% SDS, frakcjonowano przez SDS-PAGE (12% żel akrylamidowy) i przenoszono na membranę PVDF (Immobilon-P, Millipore). Bloty wywoływano przy użyciu przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z fosfatazą alkaliczną (Sigma) i systemu detekcji Immun-Star AP (Bio-Rad). Do detekcji użyto następujących przeciwciał: murine monoclonal anti-lamin Dm0 (1:2000; ADL6749), rabbit polyclonal anti-lamin C25 (1:10000), murine monoclonal anti-beta Actin (1:3000; ab8224, Abcam).

Wizualizacja chromatyny przez barwienie histonem H4 lub DAPI

Komórki Lam-KD, LBR-KD lub kontrolne S2 wysiewano na szkiełkach nakrywkowych przez 30 min. Po przepłukaniu PBS, komórki utrwalano w 100% metanolu przez 5 min w temperaturze pokojowej (w celu dalszego badania dystrybucji chromatyny na podstawie barwienia histonu H4) lub w 4% formaldehydzie w PBS przez 25 min w temperaturze pokojowej (w celu dalszego oszacowania objętości chromatyny na podstawie barwienia DAPI), trzykrotnie przepłukiwano PBS, blokowano PBTX (PBS z 0,1% Tween-20 i 0,3% Triton X-100) zawierającym 3% normalnej surowicy koziej (Invitrogen) przez 1 h w temperaturze pokojowej. Pozostałą procedurę barwienia immunologicznego przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem50. Jako przeciwciała pierwszorzędowe stosowaliśmy monoklonalne anty-histon H4 (1:200; ab31830, Abcam), poliklonalne anty-LBR26 świnki morskiej (1:1000), poliklonalne anty-lamin Dm051 królika (1:500). Jako przeciwciał drugorzędowych użyto koziej IgG anty-rabbitowej sprzężonej z Alexa Fluor 546 (Invitrogen) lub koziej IgG anty-mysiej sprzężonej z Alexa Fluor 488 (Invitrogen), lub koziej IgG anty-świnki morskiej sprzężonej z Alexa Fluor 633 (Invitrogen).

ImageJ kwantyfikacja dystrybucji chromatyny

Używając ImageJ, zmierzyliśmy profile histonu H4, LBR i laminu Dm0 na średnicy jądra w równikowej płaszczyźnie ogniskowej jąder komórek Lam-KD, LBR-KD lub kontrolnych S2. Wyodrębniano intensywności fluorescencji, poszczególne profile normalizowano najpierw do średniej intensywności, następnie do średnicy jądra (ograniczonej szczytami fluorescencji LBR w przypadku Lam-KD lub szczytami fluorescencji laminu Dm0 w przypadku LBR-KD) i dalej wyrównywano w celu określenia profilu uśrednionego. Analizowano jądra z 2-3 niezależnych eksperymentów (60 jąder na eksperyment).

Oszacowanie objętości chromatyny barwionej DAPI

Konfokalne obrazy zawierające 20-30 barwionych DAPI, utrwalonych formaldehydem komórek Lam-KD lub kontrolnych S2 przetwarzano i analizowano z tymi samymi parametrami przy użyciu oprogramowania IMARIS 7.4.2 (Bitplane AG). W komórkach Lam-KD do analizy wykorzystywano tylko jądra z najniższym szczątkowym barwieniem lamin Dm0, podczas gdy w komórkach kontrolnych, odwrotnie, jądra ze słabym barwieniem lamin Dm0 nie były brane do analizy. W celu odjęcia tła, obrazy były progowane do ~15% maksymalnej intensywności kanału, tak aby wygenerowane powierzchnie jąder nie rozszerzały się poza szczyt intensywności fluorescencji LBR. Przy tych parametrach powierzchnie jąder, odpowiednie do analizy, były automatycznie rekonstruowane. Na koniec, z zakładki Statistics pobierane były objętości ~100 zrekonstruowanych jąder do analizy.

Dwukolorowe sondy FISH

~20-kb FISH generowano przy użyciu zestawu do PCR dalekiego zasięgu (Encyclo Plus PCR (Evrogen)) poprzez amplifikację PCR 4 fragmentów genomu obejmujących region 2 L:16964000-16982000 lub 2 L:17310000-17328000, z użyciem par starterów podanych w Tabeli Dodatkowej 1. 1 µg szablonowego DNA do hybrydyzacji znakowano metodą random primed synthesis przy użyciu zestawu do znakowania DNA DIG (Roche) lub metodą ChromaTide Alexa Fluor 546-14-dUTP (Life Technologies). Sondy były dalej łączone i hybrydyzowane z komórkami S2, jak opisano wcześniej23. Do detekcji sond NL lub FISH, jako przeciwciała pierwotne stosowaliśmy poliklonalne przeciwciała świnki morskiej anty-LBR26 (1:1000), lub poliklonalne przeciwciała królika anty-lamina Dm051 (1:500) i poliklonalne przeciwciała owcy anty-DIG-FITC (1:500, Roche). Jako przeciwciał drugorzędowych użyto koziej IgG przeciw śwince morskiej sprzężonej z Alexa Fluor 633 (Invitrogen) lub koziej IgG przeciw królikom sprzężonej z Alexa Fluor 546 (Invitrogen) i koziej IgG przeciw FITC sprzężonej z Alexa Fluor 488 (Invitrogen).

Pomiar odległości między sondami FISH a NE

Trójwymiarowe stosy obrazów rejestrowano za pomocą laserowego mikroskopu skaningowego konfokalnego LSM 510 Meta (Zeiss). Rejestrowano przekroje optyczne w odstępach 0,4μm wzdłuż osi Z. Obrazy były przetwarzane i analizowane za pomocą oprogramowania IMARIS 7.4.2 (Bitplane AG) przy ślepej konfiguracji eksperymentalnej. Odległości pomiędzy obiema sondami lub pomiędzy sondami a NE były liczone zgodnie z wcześniejszym opisem23. W skrócie, nie byliśmy w stanie w pełni automatycznie zrekonstruować powierzchni jąder na podstawie ich barwienia LBR lub laminu Dm0. Dlatego obrzeże jądrowe konkretnego jądra zostało ręcznie obrysowane we wszystkich przekrojach optycznych stosu przez środek jego barwienia LBR lub lamin Dm0, aby dalej automatycznie zrekonstruować powierzchnię tego jądra. Aby określić odległość między sygnałami FISH a NE, „punkt pomiarowy” instrumentu umieszczano na najjaśniejszym wokselu sondy FISH, a kolejny „punkt pomiarowy” umieszczano na zrekonstruowanej powierzchni jądra w miejscu jej najwcześniejszego przecięcia ze stopniowo rosnącą sferą od pierwszego „punktu pomiarowego”. Dla każdego jądra mierzono odległość pomiędzy dwoma „punktami pomiarowymi” (tj. najkrótszą odległość pomiędzy środkiem sondy FISH a środkiem NE). Odległości pomiędzy dwoma sondami FISH były mierzone odpowiednio. Dane uzyskano w dwóch niezależnych eksperymentach dla 75-100 jąder w każdym eksperymencie. Równolegle pobierano objętości jąder i obliczano promienie jąder, przyjmując, że są one kuliste. W końcu, odległości zostały znormalizowane do promieni jąder.

Analiza ekspresji genów

Totalne RNA zostało wyizolowane z Lam-KD lub kontrolnych komórek S2 przy użyciu odczynnika Trizol (Invitrogen), a zanieczyszczające DNA zostało usunięte przez traktowanie DNazą I. Jakość RNA została oceniona za pomocą elektroforezy kapilarnej przy użyciu urządzenia Bioanalyzer 2100 (Agilent). Poli(A)+ RNA ekstrahowano z całkowitego RNA przy użyciu kulek magnetycznych oligo(dT) (Thermo Fisher Scientific). Do przygotowania bibliotek użyto zestawu NEBNext Ultra II RNA library preparation kit (New England Biolabs) zgodnie z instrukcją producenta. Biblioteki z dwóch biologicznych powtórzeń komórek Lam-KD lub kontrolnych S2 były kwantyfikowane przy użyciu fluorometru Qubit i ilościowego PCR, a następnie sekwencjonowane na Illumina NextSeq, uzyskując 8,4-9,4 × 106 80-nt single-end reads. Odczyty mapowano do genomu referencyjnego D. melanogaster (wersja dm3) przy użyciu HISAT52 v2.1.0 z opcją -max-intronlen 50,000. Odczyty o niskiej jakości mapowania zostały usunięte przy użyciu SAMtools53 z opcją -q 30. Obliczyliśmy poziomy transkrypcji log2 w 20-kb binach genomowych przy użyciu BEDtools54 v2.16.2 z opcją -split, a następnie zastosowaliśmy funkcję hclust w R do skupienia replik przy użyciu współczynnika korelacji 1-Spearmana jako metryki odległości. Ekspresja genów została określona ilościowo przy użyciu StringTie52 dla wersji referencyjnej anotacji r5.12. Odfiltrowaliśmy geny z zerową ekspresją w więcej niż dwóch powtórzeniach. Spośród pozostałych 10 076 genów, geny wykazujące różną ekspresję zostały zdefiniowane przy użyciu pakietu edgeR55 z normalizacją TMM (trimmed mean of M values) przy FDR = 0,05. Geny przypisywano do LADs, jeśli ich TSSs znajdowały się w obrębie LADs, natomiast geny przypisywano do inter-LADs, jeśli ich TSSs były oddalone od LADs o co najmniej 1-kb. Do wszystkich wartości ekspresji dodawano pseudokwotę, aby pozbyć się zer. Pseudokontrola była obliczana jako minimalna wartość w tabeli ekspresji genów po normalizacji. Następnie uśredniliśmy replikacje i obliczyliśmy wartości log2(FC) pomiędzy próbkami Lam-KD i kontrolnymi.

Real-time RT-qPCR assay for the randomly selected genes from different LADs was performed on cDNAs synthesised with oligo(dT) primers on the poly(A)+ RNA isolated from 3 biological replicates of Lam-KD or control S2 cells, using EvaGreen chemistry (Jena Bioscience) and the CFX96 hardware (BioRad). Poziomy ekspresji genów zostały znormalizowane w stosunku do ekspresji genu act5C. Dla potrzeb półilościowego RT-PCR, zastosowanego do analizy genów z 60D LAD, przeprowadzono odwrotną transkrypcję RNA przy użyciu odwrotnej transkryptazy SuperScript II (Invitrogen) w obecności heksamerowych starterów losowych. Amplifikację cDNA metodą PCR przeprowadzono z dodatkiem 33P-dATP. Sondy po PCR rozdzielano w 5% PAAG, które następnie utrwalano, suszono i naświetlano na ekranie fosforowym do przechowywania (Amersham Biosciences). Sygnały skanowano za pomocą urządzenia Phosphorimager Storm-820 (Molecular Dynamics). Dla każdej pary primerów liczba cykli PCR została zoptymalizowana w celu dopasowania do fazy wykładniczej amplifikacji, która była kontrolowana przez dwukrotne rozcieńczenie cDNA. Poziomy ekspresji genów zostały znormalizowane do ekspresji wszechobecnego genu CG4589. Sekwencje primerów specyficznych dla genów przedstawiono w Tabeli Uzupełniającej 1.

Procedura ChIP-seq i analiza danych

ChIP-seq z dwóch biologicznych replikacji kontroli i komórek Lam-KD S2 z przeciwciałami acetylowanymi anty-H3-pan (Active Motif, #39139) przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem56, z pewnymi modyfikacjami. Po przepłukaniu PBS, ~ 2 × 107 komórek utrwalano 1,8% formaldehydem w PBS zawierającym 0,5 mM DTT przez 20 min w temperaturze pokojowej. Sieciowanie przerywano przez dodanie glicyny do 225 mM przez 5 min i płukanie w PBS zawierającym 0,5 mM DTT trzykrotnie przez 5 min. Komórki płukano raz w buforze A2 (140 mM NaCl, 15 mM HEPES pH 7,6, 1 mM EDTA, 0,5 mM EGTA, 1% Triton X-100, 0,1% deoksycholan sodu, 0,5 mM DTT, kompletny koktajl inhibitorów proteaz bez EDTA (Roche)). Komórki lizowano w buforze A2 zawierającym 1% SDS przez 10 min w temperaturze pokojowej, po czym lizat rozcieńczano 20-krotnie buforem A2 i inkubowano przez 2 min w 4°C. Po sonikacji za pomocą VCX 400 Vibra-Cell Processor (Sonics; 30 impulsów po 10 s z 10-sekundowymi przerwami przy 15% maksymalnej mocy) i 10-minutowym szybkim wirowaniu, pofragmentowaną chromatynę (o średniej wielkości fragmentu DNA ~0,5 kb) odzyskiwano w supernatancie. Dla każdej immunoprecypitacji, ~10 μg chromatyny (~700 µl) preinkubowano w obecności 100 μl Protein A-Sepharose (PAS, 50% w/v, GE Healthcare) przez 1 h w temp. 4 °C. PAS usuwano przez odwirowanie. PAS usuwano przez wirowanie, izolowano 5% chromatyny jako materiał „Input”, po czym do reszty chromatyny dodawano 2 µl przeciwciał acetylowanych anty-H3-pan (Active Motif, #39139) i inkubowano próbki przez noc w temp. 4 °C w wirującym kole. Następnie dodawano 100 μl PAS i kontynuowano inkubację przez 4 h w temp. 4 °C. Próbki odwirowywano przy maksymalnej prędkości przez 1 min, a supernatant odrzucano. Próbki płukano czterokrotnie w buforze A2 zawierającym 0,05% SDS oraz dwukrotnie w buforze 1 mM EDTA, 10 mM Tris (pH 8), 0,5 mM DTT (każde płukanie przez 5 min w temp. 4 °C). Chromatynę eluowano z PAS w 100 μl 10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM Tris (pH 8) w temp. 65 °C przez 10 min, a następnie odwirowywano i odzyskiwano supernatant. Materiał PAS ponownie ekstrahowano w 150 μl TE, 0,67% SDS. W celu odwrócenia wiązań krzyżowych połączony eluat (250 μl) inkubowano 6 h w temp. 65 °C i poddawano działaniu Proteinazy K przez 3 h w temp. 50 °C. Próbki ekstrahowano fenolowo-chloroformowo i wytrącano izopropanolem w obecności 20 μg glikogenu. DNA rozpuszczano w 100 μl wody. Próbki ChIP zawierające ~25 ng wytrąconego DNA, jak również próbki „Input” przygotowywano do sekwencjonowania następnej generacji przy użyciu zestawu NEBNext Ultra II DNA library prep kit for Illumina (New England Biolabs). Biblioteki sekwencjonowano na aparacie Illumina HiSeq 2000, uzyskując 3,1-3,4 × 106 75-bp single-end reads. Odczyty mapowano do genomu referencyjnego D. melanogaster (wersja dm3) przy użyciu Bowtie 2 v2.2.1 (z opcją -very-sensitive)57. Odczyty o niskiej jakości mapowania usuwano przy użyciu programu SAMtools53 z opcją -q 30. Duplikaty odczytów usuwano przy użyciu SAMtools rmdup. Obliczyliśmy log2 ChIP i sygnały wejściowe w 1-kb binach genomowych przy użyciu BEDtools54 v2.16.2, a następnie zastosowaliśmy funkcję hclust w R do klasteryzacji replik przy użyciu współczynnika korelacji 1-Spearmana jako metryki odległości. Odczyty były przypisywane do LAD, jeśli nakładały się na LAD, natomiast odczyty były przypisywane do inter-LAD, jeśli były oddalone od LAD o co najmniej 1-kb. Obliczaliśmy liczbę odczytów w obrębie każdego LAD i inter-LAD, normalizowaliśmy wartości dla sumy pokrycia odczytów na replikę, wykluczaliśmy z dalszej analizy LAD i inter-LAD z zerowym pokryciem, uśrednialiśmy repliki i obliczaliśmy wartości log2(FC) pomiędzy próbkami Lam-KD i kontrolnymi próbkami ChIP.

Procedura Hi-C i analiza danych

Biblioteki Hi-C z dwóch niezależnych biologicznych powtórzeń komórek S2 kontrolnych i Lam-KD przygotowano zasadniczo jak opisano wcześniej36 przy użyciu enzymu restrykcyjnego HindIII-HF (NEB). Biblioteki poddano sekwencjonowaniu na platformie Illumina HiSeq 2000, uzyskując 3-4 × 107 sparowanych zakończeń odczytów. Odczyty mapowano do genomu referencyjnego D. melanogaster (wersja dm3) przy użyciu Bowtie 2 v2.2.1 (z opcją -very-sensitive)57. Dane Hi-C zostały przetworzone przy użyciu potoku ICE v0.9 (20 iteracji iteracyjnej korekcji), jak opisano58. Uzyskano mapy interakcji Hi-C o rozdzielczości 20-kb. TAD były przewidywane przy użyciu oprogramowania Armatus59 v1.0, w którym średni rozmiar i liczba TAD jest określana przez parametr skalowania γ. Adnotacja TAD została przeprowadzona w dwóch etapach, jak opisano36. Po pierwsze, ręcznie dobraliśmy parametr γ, aby uzyskać dobry podział TAD (γ = 1,20 dla komórek Lam-KD i γ = 1,12 dla komórek kontrolnych). Następnie, TAD większe niż 600 kb zostały podzielone na mniejsze TAD z parametrem skalowania γ pomnożonym przez 2. Następnie, najmniejsze TAD (równe lub mniejsze niż 60 kb) zostały anotowane jako inter-TAD ze względu na ich słabo rozwiązaną strukturę wewnętrzną. W rezultacie ujawniono 576 (w kontroli) i 588 (w Lam-KD) TAD. Aby zbadać, czy pozycje TAD są zmienione po Lam-KD, przeanalizowaliśmy stopień nakładania się każdego TAD w połączonych replikach komórek kontrolnych i Lam-KD z tym w replikach kontrolnych lub w replikach Lam-KD i nie znaleźliśmy statystycznie istotnej różnicy (P > 0,05 w dwustronnym teście Wilcoxona). ACF w obrębie każdego TAD obliczono jako średnią wartość iteracyjnie skorygowanych liczb odczytów pomiędzy wszystkimi binami genomowymi należącymi do TAD, z wyłączeniem binów granicznych z obu stron TAD. ACF w obrębie każdego inter-TAD obliczono jako średnią wartość iteracyjnie skorygowanych liczb odczytów między wszystkimi genomowymi pinami należącymi do inter-TAD i pinami granicznymi sąsiednich TAD. Dla każdego TAD obliczaliśmy stosunek wartości ACF w każdej replikacji Lam-KD do wartości ACF w każdej replikacji kontrolnej (w sumie cztery współczynniki). TADs z co najmniej trzema stosunkami tego samego znaku zostały użyte do dalszej analizy. Zwracamy uwagę, że gdy wybieraliśmy TADs według bardziej rygorystycznego kryterium (tj. wszystkie cztery współczynniki zmieniały się w tym samym kierunku), nie miało to wpływu na wyniki analizy (Supplementary Fig. 6). Przedziały chromatyny anotowano przy użyciu analizy składowych głównych, jak opisano17. Wykresy siodłowe zostały wygenerowane zgodnie z opisem58. W skrócie, użyliśmy obserwowanych/oczekiwanych map Hi-C, które obliczyliśmy z 20-kb iteracyjnie skorygowanych map interakcji cis-interakcji poprzez podzielenie każdej przekątnej macierzy przez jej średnią wartość w całym chromosomie. W każdej obserwowanej/oczekiwanej mapie zmieniliśmy układ wierszy i kolumn w kolejności rosnących wartości PC1 (które obliczyliśmy dla macierzy kontrolnych). Na koniec zagregowaliśmy wiersze i kolumny wynikowej macierzy w 20 równej wielkości zagregowanych koszy, uzyskując w ten sposób wykres siodłowy przedziałowości.

Analiza opublikowanych danych

Wykorzystaliśmy adnotację typu chromatyny dla komórek S240. Obliczono proporcje typów chromatyny w 20-kb binach. Anotacja LAD została zaczerpnięta z ref. 28. Obliczyliśmy proporcje długości LAD w każdym 20-kb bin TAD.

Modelowanie polimerów

Wykorzystaliśmy Dissipative Particle Dynamics (DPD) do przeprowadzenia symulacji komputerowych, jak wcześniej opisano36 z pewnymi modyfikacjami. W skrócie, makrocząsteczki są reprezentowane w kategoriach modelu koralikowo-sprężynowego, z cząsteczkami oddziałującymi przez siłę konserwatywną (odpychanie), siłę dyssypatywną (tarcie) i siłę losową (generator ciepła). Szczegółowy opis implementacji tej techniki został przedstawiony wcześniej60. Symulowana objętość komórki wynosiła 50 × 50 × 50 jednostek DPD, gęstość jest równa 3, więc całkowita liczba cząstek w układzie wynosi 375 000. Zakładamy, że cząstka odpowiada nukleosomowi. Dodatkowo, wprowadzamy specjalne warunki brzegowe, które są periodyczne dla rozpuszczalnika i nieprzepuszczalne dla pozostałych cząstek. Powierzchnia składa się z nieruchomych, heksagonalnie ustawionych cząstek. W naszych symulacjach, cząsteczki naśladują „aktywne” lub „nieaktywne” typy nukleosomów, podczas gdy powierzchnia naśladuje NL. „Nieaktywne” cząsteczki mogą tworzyć odwracalne wiązania „nasycające „61,62 zarówno ze sobą, jak i z cząsteczkami powierzchni. Każda „nieaktywna” cząsteczka może mieć tylko jedno dodatkowe wiązanie na moment, co symuluje oddziaływanie dodatnio naładowanego histonowego ogona nieacetylowanego nukleosomu z „kwaśną łatą” innego nukleosomu42,43,63. Nasz łańcuch kopolimerowy jest reprezentowany przez 64 bloki, z których każdy składa się z 500 „nieaktywnych” i 50 „aktywnych” cząsteczek. Prawdopodobieństwo utworzenia asocjacji pomiędzy dwoma „nieaktywnymi” cząsteczkami ustalono na 0.001, pomiędzy „nieaktywną” cząsteczką a powierzchnią – 0.007, natomiast prawdopodobieństwo zerwania takiej asocjacji ustalono na 0.01. Podczas symulacji wszystkie cząstki były sprawdzane co 200 kroków DPD, kiedy to uzyskiwano lokalną równowagę. Wykonaliśmy 10 niezależnych przebiegów na superkomputerze MSU „Lomonosov-2” używając własnej implementacji kodu DPD z równoległą dekompozycją domenową, która jest dostępna na GitHub .

Analiza statystyczna

Zastosowaliśmy test Wilcoxona do sprawdzenia, czy rozkład wartości log2(FC) był symetryczny wokół zera, jak również do sprawdzenia, czy dwa rozkłady wartości log2(FC) różniły się przesunięciem lokalizacji o zero.

Podsumowanie raportu

Dalsze informacje na temat projektu eksperymentu są dostępne w Nature Research Reporting Summary powiązanym z tym artykułem.

.