Abstract
Cellular metabolizm zależy od odpowiedniego stężenia wewnątrzkomórkowego fosforanu nieorganicznego (Pi). Geny reagujące na głód Pi wydają się być zaangażowane w wiele szlaków metabolicznych, co sugeruje istnienie złożonego systemu regulacji Pi w mikroorganizmach i roślinach. Do absorpcji i utrzymania odpowiedniego poziomu fosforanu, który jest uwalniany z estrów i bezwodników fosforanowych, niezbędna jest grupa enzymów. System fosfataz jest szczególnie przydatny do badania mechanizmów regulacyjnych, ponieważ aktywność fosfataz można łatwo zmierzyć przy użyciu specyficznych metod, a różnica pomiędzy poziomem aktywności fosfataz w stanie represji i derepresji jest łatwa do wykrycia. W niniejszej pracy przeanalizowano system fosfataz białkowych indukowanych podczas głodu fosforanowego u różnych organizmów.
1. Wprowadzenie
Regulacja procesów komórkowych, takich jak różnicowanie komórkowe, proliferacja, śmierć komórki, mobilność, metabolizm, przetrwanie i organizacja cytoszkieletu, w odpowiedzi na pewne bodźce jest fundamentalne dla wszystkich aspektów życia komórkowego . Fosforylacja białek jest jednym z najczęstszych mechanizmów wykorzystywanych do regulacji tych procesów. Procesy, które są odwracalnie kontrolowane przez fosforylację białek wymagają zarówno kinazy białkowej i fosfatazy białkowej .
Tradycyjnie, kinazy białkowe były badane bardziej intensywnie niż fosfatazy białkowe ze względu na wcześniejszy pogląd, że kinazy białkowe nadają precyzyjną regulację fosforylacji białek, podczas gdy fosfatazy białkowe działają jedynie w celu usunięcia grup fosforanowych. Dopiero w ostatniej dekadzie uświadomiono sobie, że fosfatazy białkowe są również regulowane przez różne mechanizmy i mają nie mniejsze znaczenie dla fizjologii komórkowej niż kinazy białkowe. Fosfatazy białkowe są zdolne do hydrolizy metabolitów fosfomonoestrowych, uwalniając fosforan nieorganiczny (Pi) z tych substratów.
Fosfor, w postaci fosforanu nieorganicznego (Pi), jest jednym z najważniejszych makroelementów dla wszystkich organizmów. Jest on nie tylko wykorzystywany w biosyntezie składników komórkowych, takich jak ATP, kwasy nukleinowe, fosfolipidy i białka, ale jest również zaangażowany w wiele szlaków metabolicznych, w tym transferu energii, aktywacji białek i procesów metabolicznych węgla i aminokwasów. Duże ilości fosforanu są wymagane do przetrwania komórek. W roślinach, Pi jest niezbędne do wzrostu i rozwoju . U grzybów szlak transdukcji sygnału Pi reguluje ekspresję wielu genów reagujących na fosforan, które biorą udział w wymiataniu i pobieraniu Pi ze źródeł pozakomórkowych. W trypanosomatid pasożytów, Pi wpływa na ich zdolność do prawidłowego wzrostu i kolonizacji w bezkręgowców gospodarza .
Podsumowując, fosfatazy białkowe i kinazy są niezbędne dla homeostazy Pi podczas nabywania, przechowywania, uwalniania i integracji metabolicznej Pi . Celem tego artykułu jest podsumowanie regulacji fosfataz przez fosforan nieorganiczny, z naciskiem na rolę tych enzymów w biologii komórki.
2. Kontrola zwrotna fosfataz przez fosforan nieorganiczny: The PHO Pathway
Saccharomyces cerevisiae posiada kilka fosfataz o różnej specyficzności, lokalizacji komórkowej oraz permeaz wykorzystywanych w wychwycie Pi. Zestaw genów odpowiedzialnych za te działania są koordynacyjnie represjonowane przez stężenie Pi w podłożu wzrostowym. Nabywanie, magazynowanie, uwalnianie i metaboliczna integracja Pi przez komórki wymaga udziału wielu istotnych enzymów, takich jak zewnątrzkomórkowe fosfatazy kwaśne (APazy), fosfodiesterazy, transportery Pi, kinazy polifosforanowe, fosfatazy zasadowe (ALPazy) i endopolifosfatazy. Aktywność tych enzymów jest nierozerwalnie związana z homeostazą Pi i podlega regulacji poprzez szlak transdukcji sygnału Pi (PHO) w odpowiedzi na zmienne poziomy Pi .
W jednym z aktualnych modeli regulacji PHO, pozytywny regulator (lub pozytywny czynnik) Pho4p, kodowany przez gen PH04, jest niezbędny do transkrypcyjnej aktywacji genów PHO poprzez swoją aktywność i lokalizację. W środowisku o wysokim Pi, kompleks kinazy zależnej od cykliny (CDK) składający się z Pho80p i Pho85p hamuje funkcję Pho4p poprzez hiperfosforylację. Hiperfosforylowany Pho4p pozostaje w cytoplazmie i nie jest w stanie aktywować transkrypcji genów PHO. Gdy stężenie Pi w podłożu jest wystarczająco niskie, Pho81p hamuje działanie kompleksu Pho80p-Pho85p, umożliwiając Pho4p przemieszczenie się do jądra i aktywację transkrypcji genów PHO. Geny te kodują transportery o wysokim powinowactwie Pho84p i Pho89p; wydzielane fosfatazy kwaśne Pho5p, Pho11p i Pho12p; inne pokrewne białka, które zwiększają odzyskiwanie Pi ze źródeł pozakomórkowych .
Ta ścieżka PHO została opisana u różnych organizmów, takich jak rośliny, bakterie i grzyby .
3. The Phosphatase System in Yeast
Początkowo zaobserwowano, że kilka genów fosfataz jest modulowanych przez stężenie Pi w podłożu hodowlanym; w ten sposób szlak PHO został początkowo scharakteryzowany przez różnie wyrażone fosfatazy .
W S. cerevisiae, transkrypcja genów kodujących kwaśne i zasadowe fosfatazy oraz transporter Pi jest koordynacyjnie represjonowana i derepresjonowana w zależności od stężenia Pi w podłożu hodowlanym . Większość fosfataz syntetyzowanych w warunkach ograniczających Pi jest zlokalizowana zewnątrzkomórkowo lub jest związana z błoną plazmatyczną lub ścianą komórkową.
Geny fosfataz regulowanych przez Pi obejmują PHO5 , który koduje główną frakcję represyjnych fosfataz kwaśnych (rAPase; optimum pH 3-4; EC 3.1.3.2), oraz jego izozymy PHO10 i PHO11 . Te trzy rAPazy są glikoproteinami, które znajdują się w ścianie komórkowej lub w przestrzeni peryplazmatycznej. Są one odpowiedzialne za wymiatanie fosforanów i współpracują z transporterami o wysokim powinowactwie w celu pozyskiwania fosforanów, gdy stężenie Pi w środowisku jest niskie. RAPaza kodowana przez gen PHO5 ulega glikozylacji podczas sekrecji przez błonę i jest zlokalizowana w przestrzeni peryplazmatycznej. Pho5p jest odpowiedzialny za >90% aktywności APazy .
Ponieważ produkt genu PHO5 stanowi większość fosfataz kwaśnych, regulacja PHO5 jest kluczowa dla komórkowej homeostazy fosforanowej. Aktywatory transkrypcyjne, Pho4p i Pho2p, są wymagane do wytworzenia aktywnej struktury chromatyny w promotorze PHO5 i stymulacji transkrypcji. Pho80p-Pho85p jest kompleksem cykliny i kinazy zależnej od cykliny, który fosforyluje Pho4p w wielu miejscach, aby negatywnie regulować funkcję Pho4p. Huang i O’Shea przeprowadzili wysokowydajny, ilościowy, enzymatyczny screen kolekcji delecji drożdży, poszukując nowych mutantów defektywnych w ekspresji PHO5. Spośród mutantów konstytutywnych, szczepy pho80 i pho85 wykazały najbardziej podwyższony poziom aktywności fosfatazy Pho5 i mRNA PHO5 w warunkach wysokiego poziomu fosforanów, co wskazuje na ich centralną rolę w szlaku PHO. Całkowita utrata wysokiej aktywności kinazy (Pho80p-Pho85) skutkuje pełną aktywacją czynnika transkrypcyjnego Pho4, prowadząc do pełnej ekspresji PHO5.
Inną ważną klasą fosfataz w S. cerevisiae są fosfatazy zasadowe (ALPase; optimum pH 8; EC 3.1.3.1). PHO8 koduje niespecyficzną represyjną fosfatazę alkaliczną (rALPase). Jest to glikoproteina zlokalizowana w wakuoli, która rozszczepia różne substraty w celu odzyskania fosforanów z produktów wewnątrzkomórkowych. Pho8p jest zależnym od Mg2+/Zn2+ białkiem dimerycznym, podobnym do ALPazy w Escherichia coli i komórkach ssaków. Produkt enzymatyczny PHO13 jest białkiem monomerycznym i jest specyficzny dla fosforanu p-nitrofenylu (pNPP) i fosforanu histydynylu. Enzym ten był silnie aktywowany przez jony Mg2+, z optimum pH 8,2 i wysoką aktywnością specyficzną dla pNPP, ze średnią wartością 3,6 × 10-5 M .
4. Phosphorus Stress Modulates Acid Phosphatases in Plants
Fosfatazy kwaśne (APases) mogą być aktywne wobec szerokiego zakresu fosforanów organicznych obecnych w glebie. Enzymy te są niespecyficznymi fosfohydrolazami monoestrów ortofosforowych (EC 3.1.3.2), które rozszczepiają Pi z miejsc wiązań estrowych. Wydzielane fosfatazy roślinne utrzymują 50% aktywności w szerokim zakresie pH (4,0-7,6), utrzymują 80% aktywności w szerokim zakresie temperatur (22°C-48°C) i są stabilne w temperaturach do 60°C, co czyni je idealnymi kandydatami na aktywne enzymy glebowe.
APazy występują obficie w Arabidopsis i są reprezentowane przez co najmniej cztery rodziny genów. Ostatnie badania anotowanego genomu Arabidopsis zidentyfikowały sekwencje dla 1 APazy Hisa, 4 fosfatydowych APaz, 10 wegetatywnych APaz białek magazynujących i 29 purpurowych APaz .
W ostatnich latach wzrosło zainteresowanie purpurowymi APazami (PAP). Analiza porównawcza struktury PAPs z roślin wyższych i ssaków pozwoliła na identyfikację konserwowanych motywów sekwencyjnych i strukturalnych w tego typu enzymach z wielu gatunków eukariotycznych .
Biochemicznie, roślinne PAP funkcjonują jako białka homodimeryczne o masie cząsteczkowej ~55 kDa na monomer, podczas gdy PAP ssaków są zwykle białkami monomerycznymi o masie cząsteczkowej ~35 kDa . Wiele PAP jest glikoproteinami, które są skierowane do szlaku wydzielniczego . Stwierdzono, że jeden PAP z Spirodela oligorrhiza jest zakotwiczony w komórce w postaci glikozylofosfatydyloinozytolu. Strukturalnie, roślinne PAP mają dwie domeny. Domena NH2 nie pełni funkcji katalitycznej. Domena COOH zawiera centrum metaliczne i jest domeną katalityczną enzymu. Inna PAP z Lupinus albus może zawierać trzecią domenę, o strukturze przypominającej desaturazę sterolową, na jej karboksylowym terminalu. Nie wiadomo, na ile te dwie ostatnie formy modyfikacji posttranslacyjnej s± powszechne w PAP innych gatunków. PAPs są metaloenzymami, które w miejscu aktywnym posiadają dwujądrowy kompleks jonów metalu. Ich charakterystyczny różowo-fioletowy kolor wynika z przeniesienia ładunku przez resztę tyrozynową koordynującą jon żelazowy. Enzym ten może hydrolizować estry i bezwodniki kwasu fosforowego.
PAPs zostały wyizolowane z Phaseolus vulgaris (fasola zwyczajna) , Glycine max (soja) , Lupinus albus (łubin biały) , Lycopersicon esculentum (pomidor) , Triticum aestivum (pszenica) , Hordeum vulgare (jęczmień) , Zea maize (kukurydza) i Oryza sativa (ryż) .
Roślinna odpowiedź na głód Pi może być podzielona na dwie kategorie: specyficzna odpowiedź i ogólna odpowiedź. Specyficzne odpowiedzi promują efektywną mobilizację i pozyskiwanie Pi z pożywki wzrostowej i magazynów wewnątrzkomórkowych. Odpowiedzi ogólne pozwalają na długotrwałe przetrwanie poprzez koordynację metabolizmu komórkowego z dostępnością składników odżywczych i potencjałem wzrostu. Wdrożenie tych strategii wymaga zmian w profilach ekspresji setek genów, jak wykazały analizy transkryptomu Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) .
Podczas głodu Pi, rośliny zwiększają ekspresję fosfataz jako ogólną odpowiedź . Produkcja fosfatazy jest związana z niedoborem Pi, a pozytywna korelacja między produkcją kwaśnej fosfatazy a odżywianiem Pi została zaproponowana. Na przykład, rośliny takie jak łubin, które są bardziej wydajne w pozyskiwaniu Pi z gleby, produkują znacznie więcej fosfatazy w porównaniu ze zbożami.
Wu i wsp. przeanalizowali regulację fosfataz białkowych w Arabidopsis i stwierdzili, że trzy geny dla PAP były indukowane przez głód Pi. Dodatkowo, gen At1g25230 był indukowany ponad 2-krotnie, co wskazuje, że gen ten jest wrażliwy na głód Pi.
W genomie ryżu zidentyfikowano w sumie 26 putatywnych genów PAP, a głód Pi indukował ekspresję 10 genów PAP ryżu, co sugeruje, że odgrywają one ważną rolę w aklimatyzacji ryżu do warunków niskiego Pi .
W Lycopersicon esculentum (pomidor), LePS2, jest indukowany przez głód Pi . Zauważono, że fosfatazy LePS2 reprezentują pierwsze cytoplazmatyczne fosfatazy, które są składnikami odpowiedzi na głód Pi . Zawieszenie komórek pomidora w pożywce pozbawionej Pi prowadziło do około 4-krotnego wzrostu aktywności specyficznej dla PAP, podczas gdy aktywność specyficzna dla PAP pozostawała niska i stała w komórkach utrzymywanych w pożywce o wysokim Pi. Wzrost aktywności PAP w komórkach rosnących w pożywce ubogiej w Pi wskazuje, że PAP może odgrywać rolę w zwiększaniu dostępności i wykorzystaniu Pi i może być kluczowy dla mobilizacji wewnątrzkomórkowego Pi poprzez wyczuwanie braku Pi w pomidorze .
5. Ektofosfatazy jako czujniki Pi
Błona plazmatyczna komórek może zawierać enzymy, których miejsca aktywne skierowane są raczej w stronę medium zewnętrznego niż cytoplazmy. Aktywność tych enzymów, zwanych ektoenzymami, może być mierzona przy użyciu nienaruszonych komórek. Ektofosfatazy i ektokinazy zostały wykryte u kilku mikroorganizmów, w tym pierwotniaków, bakterii i grzybów.
Wiele badań wykazało rolę ektofosfataz w pozyskiwaniu Pi do wykorzystania we wzroście różnych typów komórek. W komórkach grzybów (Fonsecae pedrosoi), zubożenie Pi z podłoża hodowlanego najwyraźniej indukuje ekspresję różnych aktywności ektofosfataz. Wykazano, że hodowla tych grzybów przy braku egzogennego Pi prowadzi do wytworzenia komórek grzybów wyrażających aktywność ektofosfatazy 130-krotnie wyższą niż aktywność wyrażana przez grzyby hodowane w obecności Pi. Komórki Trypanosomatidów posiadają ektofosfatazy, które dostarczają Pi poprzez hydrolizę metabolitów fosfomonoestrowych. Na przykład u T. rangeli, niskie stężenie Pi w podłożu wzrostowym indukuje ekspresję innej aktywności ektofosfatazy, co sugeruje, że enzym ten prowadzi do hydrolizy związków fosforylowanych obecnych w środowisku zewnątrzkomórkowym. Hydroliza ta może przyczyniać się do pozyskiwania Pi podczas rozwoju epimastigotów T. rangeli.
W warunkach ograniczenia Pi, bakterie fluorescencyjne Pseudomona wykazują ekspresję zestawu genów głodzenia fosforanowego. Na przykład, co najmniej 56 białek głodu Pi jest indukowanych w szczepie P. putida KT2442 , a w szczepie P. fluorescens DF57 odnotowano indukcję kilku genów głodu fosforanowego .
W wielu eukariotach rodzina białek pirofosfatazy/fosfodiesterazy nukleotydowej (E-NPP) jest bezpośrednio odpowiedzialna za hydrolizę fosforanów z zewnątrzkomórkowych nukleotydów. NPP1 do -3 występują w prawie wszystkich rodzajach tkanek ludzkich, a enzymy te zawierają domenę zasadową ektonukleotydowej pirofosfatazy/fosfodiesterazy typu 1. W S. cerevisiae, NPP1 i NPP2 są regulowane przez transkrypcję regulowaną przez Pi.
6. Uwagi końcowe
Pi jest związkiem ograniczającym wzrost różnych organizmów, gdy jego dostępność jest niska w wielu ekosystemach. Indukcja aktywności fosfataz w odpowiedzi na głód Pi jest zjawiskiem powszechnym wśród organizmów pozyskujących Pi ze środowiska. Enzymy te s± zdolne do hydrolizy fosforylowanych substratów w celu dostarczenia Ľródła Pi podczas niedoboru składników odżywczych. U Saccharomyces cerevisiae sygnał głodu Pi wyzwala zwiększoną produkcję co najmniej czterech typów fosfataz: (1) fosfataz kwaśnych Pho5, Pho11 i Pho12, które zlokalizowane są w przestrzeni peryplazmatycznej; (2) fosfatazy zasadowej Pho8, która zlokalizowana jest w wakuoli; (3) fosfatazy glicerolowej Hor2; (4) putative polifosfatazy Phm5, która zlokalizowana jest w wakuoli. Wszystkie te enzymy mog± przyczyniać się do wzrostu poziomu wolnego Pi. Jednak inne funkcje mogą być przypisane tym enzymom.
Del Pozo i wsp. oczyścili kwaśną fosfatazę, AtACP5, która jest indukowana przez głód Pi w Arabidopsis thaliana. Enzym ten wykazuje dwie aktywności, hydrolizę fosforylowanych substratów i tworzenie nadtlenków. Aktywność fosfatazowa prawdopodobnie odzwierciedla rolę w mobilizacji Pi; aktywność peroksydacyjna sugeruje, że AtACP5 może również odgrywać rolę w metabolizmie reaktywnych form tlenu .
W sumie, fosfatazy indukowane głodem Pi odgrywają rolę w adaptacji organizmu do stresu, choć można znaleźć również inne role.
Podziękowania
Autorzy uznają wsparcie finansowe udzielone przez Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) i Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ). C. F. Dick i A. L. A. Dos-Santos w równym stopniu przyczynili się do powstania tej pracy.
.