Introduction

Obecność kręgów jest cechą definiującą plan budowy ciała kręgowców. Szkielet kręgów może składać się z serii sparowanych łuków neuralnych, które pokrywają rdzeń kręgowy, sparowanych łuków hemalnych, które zamykają tętnicę i żyłę ogonową, oraz, u wielu kręgowców szczękowych (gnathostomes), serii centrów, które zastępują notochord jako dominującą strukturę nośną. Kręgowe centra są bardzo zróżnicowane pod względem morfologii i składu tkanek i prawdopodobnie wyewoluowały niezależnie u wielu różnych linii gnathostomów, w tym czworonogów, ryb teleostów i ryb chrzęstnoszkieletowych. Ta pozorna zbieżność ewolucyjna rodzi pytania o embrionalne pochodzenie elementów szkieletu kręgowego u gnathostomes.

W tetrapodach, wszystkie elementy szkieletu kręgowego wywodzą się z somitów: przejściowych, dwustronnych bloków segmentowanej mezodermy przyosiowej, które tworzą się grzbietowo w zarodkowym tułowiu. Somity dzielą się na części grzbietowe i brzuszne, które dają początek odpowiednio tkance łącznej i mięśniowej („dermomyotom”) oraz tkankom szkieletowym („sclerotom”). Eksperymenty ze śledzeniem linii komórkowych przy użyciu chimer z przepiórki i wstrzyknięć fluoresceiny z dekstranem lub przeszczepów z embrionów dawców transgenicznych z GFP u aksolotla wykazały w pełni somatyczne pochodzenie szkieletu kręgów u tych taksonów, z komórkami pochodzącymi z somatycznego pochodzenia odzyskiwanymi w rozwijających się łukach i rodzącej się chrząstce centromerowej.

Odwrotnie, u ryb promieniopłetwych teleost, szkielet kręgowy wydaje się mieć podwójne pochodzenie embrionalne, z wkładem zarówno z mezodermy paraksjalnej jak i z notochordu. Centra kręgów teleostrycznych składają się z warstwy wewnętrznej (chordacentrum) i zewnętrznej, obie zbudowane z kości, która tworzy się przez kostnienie wewnątrzzębowe. U teleostów chordacentrum tworzy się jako pierwsze, poprzez wydzielanie białek macierzy kostnej (np. SPARC, kolagen typu I) z komórek „chordoblastów”, które rezydują w nabłonku notochorda. U ryb zebrafish, badania in vitro wykazały, że hodowane komórki notochorda mają zdolność do wydzielania macierzy kostnej, a eksperymenty z ablacją wykazały, że w przypadku braku notochorda, chordacentra nie tworzą się. Chordacentra teleostów są następnie otoczone przez stosunkowo późno rozwijającą się warstwę błoniastej kości pochodzącej z mezodermy przyosiowej. Dodatkowo, mutanty zebrafish z defektami patterningu somitów posiadają normalnie rozwijające się chordacentra, ale wykazują głębokie neuronalne i hemalne defekty łuku, wskazując na prawdopodobne paraksjalne mezodermalne pochodzenie tkanek łuku.

Aby ustalić, czy podwójne pochodzenie centrów kręgów jest cechą szkieletu kręgowego specyficzną dla teleostów, czy ogólną cechą gnathostomes, która została utracona w tetrapodach, potrzebne są dane na temat embrionalnego pochodzenia kręgów z grupy zewnętrznej do ryb kostnych (tj. Osteichthyes: grupa, która obejmuje tetrapody i teleosty). Ryby chrzęstnoszkieletowe (Chondrichthyes: rekiny, płaszczki, raje i holocefale) zajmują kluczową pozycję filogenetyczną jako grupa siostrzana do ryb kostnych, a dane z tej linii mogą być wykorzystane do wnioskowania o prymitywnych warunkach rozwoju ostatniego wspólnego przodka gnathostomów. Wcześniej wykazaliśmy, że kręgi u płaszczki (Leucoraja erinacea) składają się z grzbietowego kręgosłupa neuralnego, dwóch zestawów chrząstek grzbietowych, które zamykają rdzeń kręgowy (łuki neuralne i międzykręgowe), pojedynczego łuku hemalnego i kręgosłupa rozszerzającego się brzusznie oraz trójwarstwowego centrum (ryc. 1). W niniejszej pracy wykorzystujemy eksperymenty mapowania losów somitów i notochordów, jak również hybrydyzację mRNA in situ dla genów kodujących białka macierzy szkieletowej, w celu zbadania embrionalnego pochodzenia szkieletu kręgowego płaszczki. Wykazano, że wszystkie elementy szkieletu kręgów płaszczki wywodzą się z mezodermy przyosiowej, bez dowodów na komórkowy lub macierzowy udział notochordu. Rozważane obok danych z ryb kostnych, nasze ustalenia wskazują na ogólne i prawdopodobnie prymitywne paraksjalne mezodermalne pochodzenie kolumny kręgowców u kręgowców szczękowych.

Materiał i metody

(a) Somite fate mapping

Zarodki Leucoraja erinacea otrzymano z Marine Biological Laboratory (MBL) w Woods Hole, MA, i trzymano w przepływowym stole morskim w temperaturze około 16°C do S24. Przy pomocy żyletki wycięto płatek w osłonie jaja, a zarodek i żółtko przeniesiono na płytkę Petriego. Embriony znieczulano w roztworze MS-222 (100 mg l-1 metanosulfonian 3-aminobenzoesanu etylu – Sigma-Aldrich) w wodzie morskiej. CellTracker CM-DiI (Thermofisher) (5 µg µl-1 w etanolu) rozcieńczano w stosunku 1 : 10 w 0,3 M sacharozie i wstrzykiwano do brzusznych części somitów (jedna do trzech iniekcji na zarodek) za pomocą wyciąganej szklanej igły kapilarnej i wstrzykiwacza ciśnieniowego Picospritzer (rysunek 2a). Zarodki umieszczano w osłonkach jajowych i umieszczano na dnie morza w celu ich rozwoju przez około 7 lub 12 tygodni. Embriony były następnie utrwalane 4% PFA, jak opisano w Criswell i wsp. .

(b) Notochord fate mapping

Embryosy trzymano jak opisano powyżej do S14, w którym to momencie wycinano małe okienko w osłonie jaja nad zarodkiem. CM-DiI wstrzykiwano mikroiniekcję do trójkąta notochordu, jak opisano powyżej (rysunek 2b). Okno zostało następnie uszczelnione skorupką jajka dawcy i żelem Krazy Glue™ (rysunek 2c), a jajka powróciły na stół morski, aby rozwijać się przez dodatkowe 16-18 tygodni przed utrwaleniem (jak opisano w Criswell et al. ).

(c) Walidacja umiejscowienia wstrzyknięć CM-DiI

Aby zweryfikować prawidłowe umiejscowienie wstrzyknięć CM-DiI, trzy zarodki z wstrzykniętymi somitami utrwalono natychmiast po wstrzyknięciu, a trzy zarodki z wstrzykniętymi notochordami utrwalono 5 dni po wstrzyknięciu (dpi). Zarodki utrwalano w 4% paraformaldehydzie w PBS przez noc w temperaturze 4°C, płukano 3 × 15 min w PBS i barwiono DAPI w stężeniu 1 µg ml-1 przez noc w temperaturze pokojowej. Embriony z wstrzykniętym somitem obrazowano w mikroskopie Zeiss lightsheet, a embriony z wstrzykniętym notochordem obrazowano w mikroskopie Zeiss lightsheet lub mikroskopie konfokalnym LSM 780.

(d) Histologia i hybrydyzacja in situ mRNA

Znakowane CM-DiI embriony L. erinacea osadzano w parafinie i sekcjonowano na grubość 8 µm, jak opisano w O’Neill i wsp. do analizy histologicznej. Przed zatopieniem zarodki były demineralizowane w 10% EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy) przez 14 dni. Barwienie histochemiczne wykonano zgodnie z protokołem trichromu Massona wg Witten i Hall . Eksperymenty hybrydyzacji in situ dla Col1a1 (numer akcesyjny GenBank MG017616) i SPARC (numer akcesyjny GenBank MG017615) przeprowadzono na sekcjach, jak opisano w O’Neill i wsp. z modyfikacjami według Gillis i wsp.

Wyniki

(a) Udział somitów we wszystkich elementach szkieletu kręgowego płaszczki

Aby sprawdzić udział somitów w szkielecie kręgowym płaszczki, wstrzyknęliśmy mikroiniekcję CM-DiI do brzusznych części somitów (tj. przypuszczalnego sklerotomu-rys. 3a) embrionów płaszczki w stadium (S) 24 (Ballard i in. ). Ogniskowe znakowanie somitów (bez zanieczyszczenia notochordów) potwierdzono w mikroskopii świetlnej, w embrionach utrwalonych bezpośrednio po iniekcji (rysunek 3b; n = 3). Do 50-52 dpi (S31), wrzecionowate komórki rozwijającej się tkanki areolarnej centrum otaczają notochord, a mezenchyma przedszkieletowa skondensowała się wokół cewy nerwowej oraz tętnicy i żyły ogonowej. We wszystkich embrionach analizowanych na tym etapie (n = 5), CM-DiI był odzyskiwany we wrzecionowatych komórkach rozwijającej się tkanki areolarnej (rysunek 3c), wskazując na ich somityczne pochodzenie.

Do 109 dpi (S34), kręgi są w pełni rozwinięte, z łukami neuralnymi, międzywyrostkowymi i hemowymi oraz trójwarstwowym centrum (ryc. 1). W embrionach analizowanych na tym etapie (n = 4), komórki CM-DiI-pozytywne występowały w całym szkielecie kręgów. Komórki CM-DiI były obecne w chrząstkach łuków neuralnych (n = 3 kręgi u trzech zarodków) i hemalnych (n = 6 kręgów u czterech zarodków; rysunek 3d,e), jak również w wewnętrznej warstwie chrząstki (rysunek 3f; n = 2 kręgi w dwóch zarodkach), środkowej tkance areolarnej (rysunek 3g; n = 3 kręgi w trzech zarodkach) i zewnętrznej chrząstce centrum (rysunek 3h; n = 3 kręgi w trzech zarodkach). W sumie, te wyniki pokazują somityczny wkład do wszystkich głównych komponentów szkieletu kręgowego płaszczki.

(b) No evidence for notochordal contribution to the vertebral skeleton in skate

Aby sprawdzić komórkowy wkład notochordu do szkieletu kręgowego płaszczki, przeprowadziliśmy serię eksperymentów mapowania losów notochordu. U ryb chrzęstnoszkieletowych, notochord wywodzi się z małego trójkątnego regionu komórek progenitorowych („trójkąt notochorda”), który pojawia się na tylnym brzegu blastodysku w S12 . Ogniskowo znakowaliśmy trójkąt notochorda zarodków racicznicy za pomocą CM-DiI w S14 (rysunek 4a) i potwierdziliśmy lokalizację barwnika do notochordu w 5 dpi (około S17) za pomocą mikroskopii konfokalnej. U trzech embrionów badanych w S17, CM-DiI znajdował się albo tylko w notochordzie (n = 2), albo w notochordzie i tkance nerwowej (n = 1) (ryc. 4b). W żadnym przypadku nie wykryto komórek znakowanych CM-DiI w mezodermie paraksjalnej.

Zatem znakowaliśmy trójkąty notochordów kilku embrionów płaszczki w S14, i hodowaliśmy te embriony do 116-129 dpi (S34- w którym to momencie szkielet kręgowy w pełni się zróżnicował). CM-DiI odzyskano w obrębie notochordu (rysunek 4c, c′) i nabłonka notochordu (rysunek 4d, d′) w obszarach międzykręgowych kolumny osiowej (n = 5). W trzech zarodkach komórki CM-DiI-pozytywne zostały odzyskane w pozostałościach nabłonka notochorda, które utrzymują się w centrum centrum, gdzie notochord jest prawie całkowicie zastąpiony przez wewnętrzną warstwę chrząstki centrum, ale nie odzyskano żadnych CM-DiI-pozytywnych chondrocytów w samej wewnętrznej warstwie chrząstki. W żadnym innym elemencie kolumny osiowej nie zaobserwowano chondrocytów znakowanych CM-DiI. Eksperymenty te nie dostarczają zatem żadnych dowodów na komórkowy wkład notochordu do szkieletu kręgowego.

W teleostach, komórki chordoblastu w obrębie nabłonka notochordu wydzielają składniki macierzy, które tworzą acelularną kość chordacentrum. Choć płaszczki nie posiadają chordacentrum, tkanka areolarna centrum płaszczki ulega mineralizacji, a w miejscu jej powstania sąsiaduje z nabłonkiem notochorda. W celu sprawdzenia, czy komórki nabłonka podkoronowego wnoszą składniki macierzy do tkanki centrum łyżwy, scharakteryzowaliśmy ekspresję genów kodujących białka macierzy kostnej Col1a1 i SPARC w rozwijających się centrach łyżwy. Nie wykryliśmy transkrypcji Col1a1 (ryc. 5a) ani SPARC (ryc. 5b) w nabłonku notochordu. Transkrypty te lokalizowały się raczej we wrzecionowatych komórkach tkanki areolarnej (rysunek 5a,b). Wyniki te sugeruj±, że pochodz±ce z mezodermy paraksjalnej komórki samej tkanki areolarnej, a nie nabłonek notochordu, s± Ľródłem macierzy zewn±trzkomórkowej zmineralizowanej tkanki centrum kręgów płaszczki.

Dyskusja

Nasze eksperymenty mapowania losów somitów pokazują, że presumptive sclerotome przyczynia się do wszystkich komponentów kręgów u płaszczki, w tym łuków neuronalnych i hemowych oraz wszystkich tkanek trójwarstwowego centrum kręgowego. Chociaż jest możliwe, że DiI może dyfundować przez macierz zewnątrzkomórkową po wstrzyknięciu i zanieczyścić tkanki sąsiadujące z zamierzonym celem (np. notochord), kontrolowaliśmy tę możliwość poprzez obrazowanie podzbioru embrionów krótko po wstrzyknięciu, aby potwierdzić precyzję naszego znakowania, oraz poprzez przeprowadzenie uzupełniających eksperymentów mapowania losów notochordu. W tym ostatnim, stwierdziliśmy, że znakowanie CM-DiI komórek progenitorowych notochordu skutkowało wyłącznie znakowaniem notochordu i nabłonka notochordu, bez udziału tkanek kręgowych. U ryb okrętowych, komórki chordoblastu w obrębie nabłonka rdzenia wykazuj± ekspresję genów koduj±cych białka macierzy kostnej: kolagen typu I i SPARC i s± prawdopodobnie Ľródłem macierzy kostnej dla najwcze¶niejszej warstwy ¶rodka kręgów. Ponieważ płaszczki również posiadają zmineralizowaną warstwę w obrębie centrów kręgów, staraliśmy się zbadać ekspresję Col1a1 i SPARC podczas rozwoju kręgów płaszczki za pomocą hybrydyzacji mRNA in situ. Stwierdziliśmy, że geny te ulegają ekspresji wyłącznie w wrzecionowatych komórkach tkanki areolarnej (prekursor zmineralizowanej warstwy środkowej centromeru – Criswell i in.), a nie w nabłonku notochorda. Wyniki te sugerują, że komórki i składniki macierzy centrum kręgów płaszczki są całkowicie pochodzenia paraksjalnego mezodermalnego.

Po rozważeniu danych z ryb kostnych, nasze wykazanie somitycznego pochodzenia szkieletu kręgów płaszczki sugeruje, że tkanka ta była prawdopodobnie jedynym, prymitywnym źródłem tkanek szkieletu kręgów u gnathostomes, z wkładem notochordu do kości centrum reprezentującym stan pochodny ryb teleostom (ryc. 6). Dowody z wczesnych kopalnych ryb szczękowych i bezszczękowych silnie sugerują, że szkielet kręgów u ostatniego wspólnego przodka gnathostomes składał się po prostu z serii łuków neuralnych i trwałego karbunkułu, bez kości centrowej. Kilka linii gnathostomów, w tym elasmobranchowe ryby chrzęstnoszkieletowe, teleosty i tetrapody, wykształciły następnie centra niezależnie od siebie. U ich początków, kręgowe centra elasmobranchs i tetrapoda wywodziły się całkowicie z mezodermy przyosiowej, ale wewnętrzna warstwa acellularnej kości pochodzącej z notochordu została włączona do centrum z niezależnym pochodzeniem centrów teleost.

Nie jest jednak jeszcze jasne, czy ten wyspecjalizowany stan teleostów jest unikalny wśród ryb promieniopłetwych. Pomimo ostatnich zmian w schematach filogenetycznych, centra kręgowe bardzo prawdopodobnie ewoluowały niezależnie w wielu nieteleostatycznych liniach ryb płaszczkokształtnych (np. u garów i bichirów). Nie jest jednak jasne, czy notochord przyczynia się do powstania różnych form centrów obserwowanych u tych taksonów. Kompleksowe analizy embrionalnego pochodzenia tkanek kręgowych u strategicznie wybranych taksonów ryb są potrzebne, aby lepiej rozwiązać ewolucyjne i rozwojowe złożenie zróżnicowanego szeregu szkieletów osiowych, prawdopodobnie kluczowej cechy kręgowców w ogóle.

Etyka

Wszystkie prace eksperymentalne przeprowadzono zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Animal Care and Use Committee w MBL.

Dostępność danych

Dane sekwencyjne związane z genami w tym badaniu są dostępne w GenBank (numer akcesyjny Col1a1 MG017616 i numer akcesyjny SPARC MG017615).

Wkład autorów

K.E.C. wymyślił badanie, wykonał badania histologiczne, mapowanie losów i eksperymenty hybrydyzacji in situ oraz sporządził manuskrypt; M.I.C. koordynował badanie i dostarczył wkład w manuskrypt; J.A.G. zaprojektował część badania, koordynował badanie i pomógł w napisaniu manuskryptu. Wszyscy autorzy wyrazili ostateczną zgodę na publikację.

Konkurencyjne interesy

Autorzy nie zgłaszają żadnych konkurencyjnych interesów.

Finansowanie

Badanie to było wspierane przez National Science Foundation DDIG (DEB 1501749), University of Chicago/Marine Biological Laboratory Graduate Student Research Award, Company of Biologists Travelling Fellowship oraz Royal Society-Shooter International Fellowship (NF160762) dla K.E.C.; stypendium Royal Society University Research Fellowship (UF130182), Isaac Newton Trust Grant (14.23z) oraz Marine Biological Laboratory Plum Foundation John E. Dowling and Laura and Arthur Colwin Research Fellowships dla J.A.G.; oraz grant National Science Foundation (DEB 1541491) i fundusze badawcze University of Chicago dla M.I.C.

Footnotes

.