Animals

Wszystkie myszy były 3-11-miesięcznymi samcami C57BL/6 w czasie badania. Myszy zakupiono w laboratoriach Jackson, umieszczono w obiekcie o kontrolowanej temperaturze (22 °C) i oświetleniu oraz zapewniono im swobodny dostęp do pożywienia i wody. Myszy poddano eutanazji poprzez przedawkowanie izofluranu. Wszystkie procedury na zwierzętach i sposób ich wykorzystania zostały zatwierdzone przez Institutional Review Committee na East Carolina University. Opieka nad zwierzętami była zgodna z Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, Institute of Laboratory Animal Resources, Commission on Life Sciences, National Research Council (Washington: National Academy Press, 1996).

Dysekcja FDB

Krytyczna dla każdej procedury wykorzystującej FDB jest staranna dysekcja, która zapobiega uszkodzeniu mięśnia (mięsień jest otoczony przez obszar gęstej tkanki łącznej) (patrz Ryc. 1). Aby ułatwić dysekcję, palce zostały przypięte do tablicy korkowej, mocując stopę w miejscu z podeszwą stopy skierowaną ku górze. Następnie uszczypnięto skórę na proksymalnym końcu stopy (powyżej kości piętowej), umożliwiając mikro-nożyczkami wykonanie nacięć wzdłuż bocznych krawędzi stopy aż do palców. Nadal uciskając skórę powyżej kości piętowej, użyto mikro-nożyczek do oddzielenia skóry od leżącej pod nią muskulatury. Pozostały płat skóry został oderwany i usunięty, aby odsłonić FDB i ścięgna palców. Następnie przecięto proksymalne ścięgno i przytrzymując je kleszczykami, odcięto FDB od leżącej pod nim powięzi. Następnie przecięto ścięgna palców, aby uwolnić FDB od stopy.

Izolacja włókien mięśniowych

Po dysekcji FDB, mięśnie umieszczono w świeżym podłożu hodowlanym (DMEM z glutaminą, 2% sterylnie filtrowany FBS, 0.1% gentamycyny) uzupełnionej o 4 mg/ml kolagenazy A (Roche – 11088793001) przez 90-120 min w 37 °C w 5% CO2, jak wcześniej opisano . Mięsień FDB został umieszczony w 2 mL podłoża hodowlanego bez kolagenazy i delikatnie tryturowany o ścianę naczynia w celu uwolnienia włókien z wiązki przy użyciu ściętego końca końcówki pipety P1000. Wyizolowane miofibry przylegały do naczyń ze szklanym dnem, które były pokryte entaktyną-kolagenem-lamininą (ECL Cell attachment matrix, #08110 Millipore). Włókna zawracano do 37 °C w 5% CO2 na kilka godzin, a następnie obrazowano jak opisano poniżej.

Długość włókien mięśniowych FDB

Mięśnie FDB samców i samic myszy C57BL/6 wiązano na proksymalnym ścięgnie i trzech przyśrodkowych ścięgnach palców jedwabnym szwem i przymocowano do metalowego klipsa, aby utrzymać napięcie spoczynkowe. Miofibry izolowano w sposób opisany powyżej, ale nie przyklejano ich do płytek z dnem szklanym. Miofibryle obrazowano przy użyciu obiektywu ×4 i mikroskopu EVOS XL core oraz towarzyszącego mu oprogramowania (Life Technologies, Bothell, WA). Długość około 1000 miofibrów mierzono w ImageJ (wersja 1.6.0, NIH, Bethesda, MD). Po wyizolowaniu, miofibryle nie były już napięte i dlatego nie reprezentowały optymalnej długości. Aby uwzględnić tę zmianę w długości miofibryli, zastosowano współczynnik konwersji wykorzystujący długość sarkomerów, jak wcześniej opisał dr Richard Lieber . Zakłada się, że optymalna długość miofibryli w mięśniu myszy przy optymalnej długości wynosi 2,5 μm w poprzek. Aby znormalizować długości miofibrów do długości sarkomerów, zmierzyliśmy długość sarkomerów w podzbiorze 30 miofibrów. Zmierzono odległość między 10 sarkomerami każdego miofibra i obliczono średnią długość sarkomerów dla wszystkich 30 miofibrów. Optymalna długość sarkomerów (2,5 μm) podzielona przez średnią zmierzoną długość sarkomerów dała współczynnik konwersji 1,14, który został użyty do normalizacji wszystkich zmierzonych długości miofibrów do optymalnej długości sarkomerów.

Indywidualny typ włókien i rozmiar włókien

Analiza typu włókien mięśniowych FDB została przeprowadzona na próbkach od myszy C57BL/6, jak opisano wcześniej . Sekcje sondowano za pomocą przeciwciał pierwotnych przeciwko łańcuchowi ciężkiemu miozyny typu I (BA-F8), IIa (SC-71), IIb (BF-F3) (Development Studies Hybridoma Bank, Univ of Iowa) i anty-dystrofiny (Rb-9024, Thermo Fisher, Waltham, MA), a następnie obrazowano za pomocą mikroskopu EVOS FL auto i towarzyszącego oprogramowania (Life Technologies, Bothell, WA). Typ włókna i obszar przekroju poprzecznego włókna (CSA) oceniano za pomocą ImageJ, jak opisano wcześniej .

Isometryczna produkcja siły

Isometryczna produkcja siły i zmęczenie oceniano w mięśniach EDL (n = 5), soleus (n = 4) i FDB (n = 6) myszy C57BL/6, jak opisano wcześniej z niewielkimi modyfikacjami. Odsłonięto FDB i zabezpieczono proksymalne ścięgno za pomocą jedwabnego szwu. Kleszczyki z drobnymi końcówkami umieszczono pod trzema ścięgnami przyśrodkowymi palców i delikatnie pociągnięto w dół w kierunku palców, zanim trzy ścięgna (ryc. 1) zostały zabezpieczone jedwabnym szwem. Związaliśmy trzy przyśrodkowe ścięgna, ponieważ nie jest możliwe związanie jednego z palców z powodu anatomicznej lokalizacji, a związanie czwartego ścięgna nie skutkuje, według naszego doświadczenia, inną siłą bezwzględną (dane nie pokazane). Każde ścięgno zostało następnie przecięte tuż powyżej węzła, a FDB delikatnie uniesiono ze stopy. Użyto mikro nożyczek do usunięcia pozostałej tkanki łącznej, uwalniając ją od stopy. Następnie mięsień przywiązywano do przetwornika siły i zawieszano w natlenionym buforze Krebsa Ringera (KRB- 115 NaCl, 2,5 KCl, 1,8 CaCl2, 2,2 Na2HPO4, 0,85 NaH2PO4) w temperaturze pokojowej. Następnie regulowano długość mięśnia do momentu uzyskania przez FDB szczytowej siły skurczu, w którym to momencie ustalano optymalne napięcie spoczynkowe (Lo) i pozwalano mięśniowi na wyrównanie się przez 10 min. Mięśnie podeszwowe przygotowywano poprzez zawiązanie podwójnego kwadratowego węzła na dystalnym ścięgnie mięśnia podeszwowego. Ścięgno przecinano powyżej węzła i delikatnie odciągano tylne mięśnie od nogi odsłaniając proksymalne ścięgno mięśnia podeszwowego, które wiązano podwójnym węzłem kwadratowym. Mięsień EDL został przecięty i podwiązany jak opisano wcześniej. EDL i mięśnie podeszwowe wyrównano w natlenionym KRB o temperaturze pokojowej przy spoczynkowym napięciu przez 10 min. Po wyrównaniu, napięcie mięśni zostało zoptymalizowane przez wykonanie maksymalnych stymulacji drgawek i dostosowanie długości mięśnia do osiągnięcia szczytowej siły. Stymulacje skurczowe wykonywano w odstępie 30 s, aby uniknąć zmęczenia mięśnia. Następnie mięśnie stymulowano w odstępie 60 s przy częstotliwości 10, 20, 40, 60, 80, 100 i 120 Hz w celu wygenerowania krzywej częstotliwości siły. Mięśnie odpoczywały przez dodatkowy 1 min przed zakończeniem 10-minutowego protokołu stymulacji w celu określenia odporności na zmęczenie. Protokół zmęczeniowy stymulował mięśnie z częstotliwością 30 Hz co 2 s przez okres 600 s, co w sumie dawało 300 skurczów. Rejestrowano optymalną długość mięśnia, a przed zważeniem mięśnie bibułowano w celu usunięcia nadmiaru KRB. Optymalne napięcie 20 V zostało ustalone przed eksperymentami, aby zapewnić maksymalną stymulację FDB, EDL i mięśnia podeszwowego (dane nie pokazane). Dane dotyczące bezwzględnej siły mięśniowej zostały przeliczone na siłę właściwą (N/cm2) przy użyciu wcześniej opisanych równań do matematycznej oceny CSA mięśni i fizjologicznego pola przekroju poprzecznego (PCSA). Podstawową różnicą między CSA i PCSA jest uwzględnienie w równaniu PCSA stosunku długości włókien mięśniowych do długości mięśnia. Użyliśmy obu skorygowanych metod, aby zapewnić szerszą zgodność z literaturą.

Pasywne właściwości kurczliwe

Pasywne właściwości kurczliwe oceniano w mięśniach EDL i FDB od myszy samców C57BL/6 (n = 4), jak wcześniej opisano , z niewielkimi modyfikacjami. Mięśnie EDL i FDB rozcięto i przywiązano do przetwornika siły, jak opisano powyżej. Mięśnie były wyrównane przez 10 min w natlenionym KRB w temperaturze pokojowej. Po wyrównaniu, napięcie mięśni było optymalizowane przez wykonanie maksymalnych stymulacji skurczowych i regulację długości mięśnia, aż do osiągnięcia szczytowej siły. Stymulacje skurczowe wykonywano w odstępie 30 s, aby uniknąć zmęczenia mięśnia. Długość referencyjna mięśnia była mierzona jako Lo przed poddaniem go pasywnemu rozciąganiu 105, 110, 115, 120, 125 i 130% Lo. Mięśnie osuszano, aby usunąć nadmiar KRB, a następnie ważono. Dane skorygowano do CSA i PCSA.

Uraz kardiotoksyny (CTX)

Porównania wykonano u myszy C57BL/6 między FDB poddanym działaniu CTX (Naja nigricollis, #02152238, MP Biomedicals, Santa Ana, CA) i kontralateralnym FDB poddanym działaniu PBS 4 dni (n = 4) i 10 dni po leczeniu (n = 2). Sterylne strzykawki 31G o długości 8 mm przygotowano z 10 μL 10 μM CTX lub 10 μL sterylnego 1× PBS, jak opisano wcześniej. Po wywołanym izofluranem znieczuleniu, podstawy stóp czterech myszy oczyszczono chusteczkami z alkoholem. CTX wstrzykiwano w proksymalną część stopy z igłą umieszczoną pod skórą i w kierunku palców. W przeciwległą stopę wstrzykiwano PBS. Myszy uśmiercano w odpowiednim czasie, a FDB były rozcinane w celu pomiaru produkcji siły, jak opisano powyżej. Dane zostały skorygowane do PCSA.

Barwienie hematoksyliną i eozyną

Mięśnie FDB poddane 10-dniowemu leczeniu CTX zostały zamrożone w roztworze o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) do sekcjonowania i barwienia H&E, jak opisano wcześniej.

Mięśnie szkieletowe wysokiej rozdzielczości respirometria mitochondrialna

Przygotowanie permeabilizowanych pęczków włókien mięśniowych brzuchatego i FDB

Respirometria została przeprowadzona na izolowanych permeabilizowanych pęczkach mięśniowych brzuchatego i FDB wyciętych z tej samej kończyny myszy C57BL/6 (n = 4). Część czerwonego mięśnia brzuchatego łydki została rozcięta i użyta do przygotowania permeabilizowanych wiązek włókien, jak opisano wcześniej. Czerwony mięsień brzuchaty łydki został użyty jako tkanka porównawcza, ponieważ jest powszechnie stosowany do oceny oddychania mitochondrialnego mięśni szkieletowych u myszy. Protokół przygotowania permeabilizowanych pęczków włókien mięśniowych FDB został zaadaptowany z wcześniej opisanych metod dotyczących permeabilizacji pęczków mięśniowych czerwonego mięśnia brzuchatego łydki i jest przedstawiony poniżej. FDB były rozcinane i natychmiast dodawane do lodowatego buforu X (-7,23 K2EGTA, 2,77 CaK2EGTA, 20 imidazolu, 20 tauryny, 5,7 ATP, 14,3 fosfokreatyny, 6,56 MgCl2-6H2O, 50 MES, pH 7,1, 295 mosmol/kgH2O). Używając mikroskopu rozcinającego, ostrożnie usuwano tkankę łączną, tłuszcz i naczynia krwionośne, aby uniknąć utraty mięśni. FDB pocięto na wiązki i podzielono na grupy składające się z trzech do czterech wiązek o masie 1,5-2,0 mg w stanie mokrym. Następnie grupy pęczków poddawano permeabilizacji w buforze X zawierającym 22,5 μg/ml saponiny przy ciągłej rotacji w temperaturze 4 °C przez 5 min. Wiązki mięśniowe natychmiast przenoszono do lodowatego buforu Z (-110 K-MES, 35 KCl, 1 EGTA, 5 K2HPO4, 3 MgCl2-6H2O, 5 mg/ml BSA, pH 7,4, 295 mosmol/kgH2O) i przemywano przy ciągłej rotacji w temperaturze 4 °C przez 15 min.

Oddychanie mitochondrialne

Pomiary zużycia O2 o wysokiej rozdzielczości wykonano za pomocą OROBOROS Oxygraph-2K (Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria) w temperaturze 37 °C ze startowym stężeniem tlenu ~ 300-350 μM, jak wcześniej opisano . Eksperymenty prowadzono w buforze Z zawierającym 20 mM monohydratu kreatyny i 25 μM blebistatyny. Oddychanie mitochondrialne oceniano przez sekwencyjne dodawanie substratów o końcowym stężeniu pirogronianu 4 mM, jabłczanu 0,5 mM, glutaminianu 5 mM, ADP 2.5 mM, bursztynian 5 mM, cytochrom c 5 μM, rotenon 10 μM, antymycyna A 5 μM, kwas askorbinowy 2 mM i TMPD 0,5 mM (dichlorowodorek N,N,N′,N′-tetrametylo-p-fenylenodiaminy). Integralność błony mitochondrialnej potwierdzono przez wykluczenie pęczków mięśniowych brzuchatego mięśnia łydki i pęczków mięśniowych FDB, które wytwarzały odpowiednio > 10 lub > 20% wzrost oddychania po dodaniu egzogennego cytochromu c. Inne kryteria wykluczenia zastosowano dla wiązek mięśniowych brzuchatego łydki i FDB, ponieważ wstępne testy wskazały, że większy procentowy wzrost oddychania był powszechny w wiązkach włókien FDB w porównaniu do wiązek włókien brzuchatego łydki, po dodaniu cytochromu c. Po zakończeniu protokołu wiązki mięśniowe płukano w destylowanej H2O, liofilizowano (Labconco, Kansas City, MO) i ważono (Orion Cahn C-35, Thermo Electron, Beverly, MA). Wskaźniki oddychania dla nienaruszonych pęczków mięśniowych mięśnia brzuchatego łydki są zwykle korygowane do suchej masy; jednakże, ze względu na różnice w zawartości tkanki łącznej w obu grupach mięśni, wartości JO2 zostały również skorygowane do białka całkowitego i aktywności syntazy cytrynianowej (CS). Aktywność CS mierzono przy użyciu zestawu CS0720. Substancje chemiczne i odczynniki zakupiono w Sigma Aldrich.

Mikroskopia

In vitro

Włókna mięśniowe FDB wyizolowano z myszy C57BL/6 i dołączono do 35-mm szklanych naczyń dolnych pokrytych ECL, jak wcześniej omówiono. Wyizolowane miofibry barwiono mitotrackerem głęboko czerwonym (M2246, Thermo Fisher) i NucBlue (R37605, Thermo Fisher) w DMEM przez 30 min. Włókna przepłukano trzykrotnie 2 mL KRB. Włókna obrazowano przy użyciu konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego z pojedynczym fotonem, z obiektywem ×60 (Olympus, Plan Apochromat, NA 1,35), a wzbudzenie uzyskiwano przy użyciu linii 405- i 488-nm wieloliniowego lasera argonowego.

In vivo

Generacja drugiej harmonicznej opisuje efekt optyczny powstały w wyniku przechodzenia impulsów laserowych przez silnie spolaryzowane, niecentrosymetryczne materiały, takie jak miozyna. Po spolaryzowaniu na odpowiedniej długości fali, materiały te emitują światło o połowie długości fali wchodzącej, tworząc obrazy o wysokiej rozdzielczości bez potrzeby stosowania sond fluorescencyjnych, które podlegają fotobieleniu i fototoksyczności. Ponadto, stosowana długość fali w bliskiej podczerwieni pozwala na głęboką penetrację tkanek bez konieczności stosowania inwazyjnych procedur. Myszy C57BL/6 zostały znieczulone przed usunięciem skóry pokrywającej FDB, odsłaniając mięsień FDB. Po odsłonięciu, FDB nawilżono sterylnym KRB, a mysz ułożono na leżąco na szklanym szkiełku nakrywkowym (#1.5, Leica), jak opisano wcześniej (Ryc. 1C). Cząsteczki miozyny i nikotynamidu wzbudzano przy 900 i 720 nm za pomocą lasera impulsowego Ti:Sapphire z blokadą trybu (seria Mai Tai Deep See HP, Spectra-Physics, Santa Clasa, CA), a emisję rejestrowano za pomocą detekcji bez skanowania z filtrem FV10 MRV/G ustawionym odpowiednio na 450 i 420 nm. Wszystkie obrazy wykonano przy użyciu obiektywu olejowego ×60 (Plan Apochromat, NA 1,35) i aparatu Olympus FV1000 LSM z oprogramowaniem do akwizycji FV10-ASW 4.2.

Elektroporacja cDNA i respirometria o wysokiej rozdzielczości mięśni szkieletowych nadekspresyjnych Pgc1α

Elektroporację cDNA do FDBs przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem . Krótko mówiąc, stopy siedmiu znieczulonych myszy C57BL/6 samców i samic oczyszczono chusteczką z alkoholem i wstrzyknięto 10 μl 2 mg/mL hialuronidazy zawieszonej w sterylnie filtrowanym KRB za pomocą 8-mm długiej 31 gauge sterylnej igły. Około 1 h później myszy poddano znieczuleniu po raz drugi. Stopy ponownie oczyszczono chusteczką alkoholową i jednej stopie wstrzyknięto 30 μg plazmidu PGC1α znakowanego zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP), a przeciwległej stopie wstrzyknięto cDNA YFP. Po pełnym odzyskaniu znieczulenia, myszy były znieczulane po raz trzeci ~ 10 min później. Elektrody platynowe wprowadzono pod skórę i umieszczono prostopadle do FDB i równolegle do siebie na pięcie i poduszce stopy pod palcami. FDB była stymulowana 20 impulsami o czasie trwania 20 ms przy częstotliwości 1 Hz i napięciu 100 V . Myszy zostały uśmiercone 14 dni później, a FDB zostały wypreparowane i zobrazowane pod mikroskopem fluorescencyjnym w celu potwierdzenia ekspresji plazmidu. Nienaruszone próbki mięśni FDB zostały następnie przygotowane i zmierzone pod kątem oddychania mitochondrialnego, jak w zarysie powyżej.

Statystyka

Rozkłady danych zostały ocenione, a dane, które nie były zgodne z rozkładem normalnym, zostały przekształcone log base 10. Dane kurczliwości częstotliwości siły były analizowane za pomocą dwukierunkowej ANOVA z wielokrotnymi porównaniami Tukey’a. Masa mięśniowa, typ włókien, czas do maksimum i połowy relaksacji oraz dane dotyczące zmęczenia były analizowane za pomocą jednokierunkowej ANOVA z wielokrotnymi porównaniami Tukey’a. W przypadkach, gdy dane nie mogły być przekształcone do rozkładu normalnego, przeprowadzono test Kruskala-Wallisa z wielokrotnymi porównaniami Dunna. Analizy ANOVA zostały wykonane przy użyciu programu GraphPad Prism 7.03. Dane oddechowe i aktywność CS analizowano za pomocą sparowanych dwuwargowych testów t z poziomem alfa 0,05 przy użyciu programu Microsoft Excel. Wszystkie dane przedstawiono jako średnie ± SEM.