Identyfikacja pleśni nitkowatych w rutynowym laboratorium klinicznym nadal opiera się głównie na badaniu mikroskopowym kolonii sporulujących. Grzyby, które nie posiadają sporokarpów lub charakterystycznych zarodników są trudne do identyfikacji (Pounder et al. 2007; Santos et al. 2013). W niniejszej pracy analizie poddano 13 szczepów jałowych lub niediagnostycznych. Na podstawie cech fenotypowych izolaty zostały zidentyfikowane jako gatunki Papulaspora ze względu na tworzenie kęp lub struktur bulwiasto-podobnych (Vinod Mootha i wsp. 2012). Przy próbach indukowania sporulacji z wykorzystaniem różnych podłoży i warunków inkubacji, niektóre szczepy wytwarzały drobne konidia na krótkich fialidach, ale nadal te konidia nie były diagnostycznie użyteczne i nie mogły być wykorzystane do identyfikacji gatunkowej.

W wyniku analizy molekularnej i filogenetycznej sześciu loci, stwierdzono, że szczepy należą do trzech nowych gatunków, które zostały opisane w niniejszej pracy. Dwa gatunki łączyły się z gatunkami typu Subramaniula, podczas gdy jeden był siostrzany z dwoma opisanymi gatunkami Chaetomium. Zarówno Subramaniula jak i Chaetomium należą do rodziny Chaetomiaceae (Sordariales). Członkowie tej rodziny charakteryzują się tworzeniem askospor w rozpływających się askusach wewnątrz mniej lub bardziej bogato zdobionych perytecji (Whiteside 1961). Fenotypowa identyfikacja gatunków w Chaetomiaceae zależy głównie od kształtu włosków askomatycznych, pigmentacji i ornamentacji ascoma oraz kształtu askospor (Ames 1961; von Arx et al. 1984). Trzy opisywane w niniejszej pracy gatunki wykazywały nietypowe cechy morfologiczne, gdyż w askomacie nie dochodziło do rozmnażania płciowego. Zamiast tego obecne były skupiska grubościennych, ciemno pigmentowanych komórek. Nie jest jasne, czy struktury te reprezentowały niedojrzałe peritecje (Davey et al. 2008). W ramach jednolitej nomenklatury dla grzybów (Taylor 2011), gatunki te są tu jednak opisane w rodzajach płciowych na podstawie ich pozycji filogenetycznej w obrębie Chaetomiaceae.

Dwa nowe gatunki zgrupowane z Subramaniula pochodzą ze źródeł klinicznych, głównie z infekcji oczu lub skóry. Koprofilny rodzaj Subramaniula jest obecnie znany z dwóch gatunków, które zostały przeniesione z Achaetomium, tj. S. irregularis i gatunku rodzaju S. thielavioides (Cannon 1986; von Arx 1985; von Arx et al. 1978). Rodzaj Subramaniula charakteryzuje się glabrowymi, bladymi ascomatami z szerokimi otworami wierzchołkowymi (Fig. 8), bez znanego morfemu bezpłciowego. Cannon (1986) podał: „Kilka hyphae z łańcuchami znacznie nabrzmiałych komórek, wytwarzających cienkościenne kuliste lub elipsoidalne ciała do 8 μm średnicy, ale mogą one nie funkcjonować jako propagule”. Niektórzy autorzy sugerowali, że ciała te mogą być związane z bezpłciowym stanem tego grzyba (Pastirčák i Pastirčáková 2009). Podczas badania byłego szczepu S. thielavioides (CBS 122.78), wykryliśmy łańcuchy obrzękniętych komórek, ale nie zaobserwowaliśmy cienkościennych ciałek. W porównaniu z naszymi dwoma nowymi gatunkami Subramaniula, u których zaobserwowano konidia, jest mało prawdopodobne, że struktury te są konidiami, ale mogą działać jako przetrwalnikowe propagule. Subramaniula irregularis (syn. Achaetomiella irregulare) jest opisana jako morfologicznie podobna do S. thielavioides z pewnymi różnicami w kształcie i wielkości askospor oraz pigmentacji ascomata, ale nie jest dostępna żywa kultura tego gatunku (Cannon 1986).

Subramaniula thielavioides (CBS 122.78). Kolonie po 1 tygodniu inkubacji na: a-b MEA awers i rewers; c OA; d Ascomata; e Ascomata wall; f-h Ascospores. – Scale bars = 10 μm

Subramaniula thielavioides została wyizolowana z próbki obornika z Indii, podczas gdy S. irregularis znana jest tylko z gleby w Afryce Południowej (Cannon 1986; von Arx et al. 1978). Do tej pory nie przypisano Subramaniula żadnej infekcji u ludzi. Jednakże Cannon (1986) doniósł o wyizolowaniu S. thielavioides z ludzkiego paznokcia i co ciekawe stwierdził, że „mikolodzy medyczni powinni być świadomi jego istnienia”. Dzięki dwóm nowo opisanym gatunkom klinicznym, potwierdzono, że rodzaj Subramaniula może być potencjalnie oportunistycznym gatunkiem powodującym infekcje skóry, oczu i paznokci. Niezidentyfikowany szczep z wrzodu rogówki, opublikowany przez Vinod Mootha i wsp. (2012), CBS 123294, został opisany w niniejszej pracy jako nowy gatunek Subramaniula asteroides. Szczep ten został wyhodowany od pacjenta noszącego soczewki kontaktowe, który został zraniony drutem podczas pracy w stadninie koni. Szczep dH 21571 dotyczył zapalenia rogówki, które pojawiło się po urazie oka ostrym liściem rośliny na polu rolnym w tropikalnych Indiach. Dwa kolejne szczepy z USA również pochodziły z wrzodów rogówki. Dwa kolejne szczepy z infekcji oczu w Hiszpanii pasowały do S. asteroides; CNM-CM 4314 został wyizolowany z wysięku rogówki 27-letniego mężczyzny, CNM-CM 7482 pochodził z endophthalmitis 47-letniego pacjenta z immunosupresją; w szklistce zaobserwowano hyphyae, a pacjent stracił oko. Subramaniula asteroides wydaje się więc mieć silny związek z traumatycznymi infekcjami oka. W trakcie tego badania inna sekwencja pochodząca z izolatu (UTHSC 03-1315) ze skóry pacjenta z Arabii Saudyjskiej została również zidentyfikowana jako S. asteroides. Jedyny izolat środowiskowy S. asteroides pochodził również z Arabii Saudyjskiej, a mianowicie z piaszczystej gleby pustynnej pod wpływem węglowodorów. Został on wyizolowany metodą wzbogacania toluenem (Zhao et al. 2010), opracowaną do izolacji grzybów rosnących w warunkach toksycznych.

Subramaniula obscura została opisana w niniejszej pracy dla pojedynczego szczepu pochodzącego od 53-letniego mężczyzny z Kuwejtu, u którego stwierdzono infekcję palca u nogi. Szczep ten został początkowo zidentyfikowany jako Chaetomium cuniculorum. Stwierdziliśmy, że szczepy C. cuniculorum są filogenetycznie spokrewnione z S. obscura, ponieważ oba znajdowały się w pojedynczym, wspieranym kladzie na podstawie zarówno analizy genów rybosomalnych (ML-BS/PP, 84%/1,0), jak i analizy wieloogniskowej genów kodujących białka (ML-BS/PP, 100%/0,99) (ryc. 2). Przy sekwencjonowaniu ITS i wykorzystaniu ograniczonej liczby taksonów, rozdzielenie tych dwóch gatunków może być rzeczywiście trudne. Sekwencja ITS byłego szczepu S. obscura, CBS 132916, wykazała 97% podobieństwo do izolatów C. cuniculorum. Uważa się, że ten ostatni gatunek występuje głównie na oborniku, a około połowa szczepów C. cuniculorum utrzymywanych w kolekcji kultur CBS pochodziła z obornika zwierząt roślinożernych. Podobieństwo ITS S. obscura do S. thielavioides wynosi 99,4%, ale geny kodujące białka są konsekwentnie różne i dlatego uzasadnione jest opisanie tego nowego gatunku w Subramaniula.

Makro- i mikromorfologia Subramaniula obscura jest podobna do S. asteroides, z wyjątkiem tego, że komórki tworzące kępy S. obscura są bardziej brązowawe i zaokrąglone, a hyfusy grubsze i z brodawkowatymi wypukłościami. Minimalna temperatura wzrostu dla obu gatunków oraz dla S. thielavioides wynosiła 6°C, a wszystkie rosły bardzo dobrze powyżej 40°C, co wskazuje na termotolerancję gatunków Subramaniula. Optymalna temperatura wzrostu wynosiła pomiędzy 33 a 36 °C, a stałe przeżycie w temperaturze 37 °C wskazuje na zdolność do wzrostu w temperaturze ludzkiego ciała jako czynnik wirulencji (Revankar i Sutton 2010).

Identyfikacja szczepu Chaetomium anamorphosum CBS 137114 jako nowego gatunku, wyhodowanego z ludzkiego zapalenia otrzewnej, została wstępnie przeprowadzona poprzez morfologiczne porównanie z opisanymi gatunkami Papulaspora. Szczep ten wykazywał pewne podobieństwo do Papulaspora nishigaharanas poprzez tworzenie skupisk brązowo zabarwionych, grubościennych komórek, jak również poprzez produkcję fialokonidiów (Watanabe 1991). Porównanie sekwencji ITS i regionu D1/D2 genu 28S rRNA w GenBanku nie wykazało homologii z żadnym znanym, sekwencjonowanym gatunkiem. Dzięki zastosowaniu podejścia filogenetyki molekularnej udało się ustalić taksonomię tego izolatu jako bliskiego krewnego gatunków askosporulujących Chaetomium irregulare i C. fusisporum (ryc. 1, 2 i 9). Nowo zidentyfikowany gatunek różnił się od C. irregulare i C. fusisporum nie tylko morfologią, ale także temperaturą wzrostu. Optymalna temperatura wzrostu C. anamorphosum wynosiła 33-36 °C, a wzrost obserwowano jeszcze w 40 °C, podczas gdy dla C. irregulare optimum wynosiło 30 °C, a w 40 °C nie był on w stanie rosnąć lub rósł słabo. Chaetomium irregulare został przeniesiony do rodzaju Achaetomium przez Rodríguez et al. (2004). Jednakże, w porównaniu z rodzajem Achaetomium globosum, okazało się, że jest on od niego odległy i nazwa Achaetomium irregulare jest zbędna. Taksonomia i nomenklatura kladu zawierającego nowy gatunek i inne Chaetomium spp. jako paraphyletic do Subramaniula są niejasne ze względu na stosunkowo dużą odległość do typu rodzajowego C. globosum. Ponadto morfologia ascomata, włosków ascomatycznych, jeśli są obecne, i askospor gatunków należących do tej klady różni się od morfologii C. globosum. Rodzaje Chaetomium, Achaetomium, Subramaniula i Achaetomiella były morfologicznie podobne, z niewielkimi różnicami w obecności i braku włosków askomatycznych, ścianie ascoma, kolorze askospor i tempie wzrostu (Cannon 1986). Te cechy stały się w dużej mierze nieistotne ze względu na dostępność danych molekularnych. W oczekiwaniu na rewizję taksonomiczną Chaetomium, utrzymujemy obecną klasyfikację gromady w obrębie tego rodzaju, uznając Subramaniula za rodzaj zagnieżdżony w Chaetomium.

Chaetomium irregulare (CBS 446.66). Kolonie na MEA: a Jeden tydzień b Cztery tygodnie inkubacji; c Asci na powierzchni agaru OA; d Ascomata; e Ascomata wall; f-g Asci; h. Ascospores. – Scale bars = 10 μm

Pomimo dużej liczby opisanych gatunków w Chaetomium i pokrewnych, niewiele wiadomo o ich taksonomii molekularnej, a tylko kilka gatunków zostało zsekwencjonowanych i jest dostępnych w publicznych bazach danych (Wang et al. 2014). Większość wcześniejszych badań ograniczała się do rzadkich gatunków, a filogeneza bardziej wszechobecnych gatunków Chaetomium pozostaje nierozwiązana (Asgari i Zare 2011; Lee i Hanlin 1999; Wang et al. 2014). Ostatnio, na podstawie analizy molekularnej czterech genów, opisano trzy nowe gatunki w grupie C. indicum (Wang et al. 2014). Innym badaniem molekularnym Chaetomium było badanie Asgari i Zare (2011) przeprowadzone w Iranie z wykorzystaniem analizy filogenetycznej trzech genów, którego efektem było wyodrębnienie sześciu nowych gatunków. Dwa z nich wykazywały morfy bezpłciowe podobne do tych tworzonych przez Chaetomium anamorphosum oraz przez oba gatunki Subramaniula opisane w niniejszej pracy. Chaetomium rectangulare Asgari i Zare (2011) należy do grupy C. globosum charakteryzującej się bezpłciowymi morfami z fialidami i konidiami bardzo podobnymi do tych u naszego nowego gatunku. Może to wskazywać, że nowe gatunki w jakiś sposób utraciły zdolność do tworzenia owocników płciowych i zastąpiły ją bezpłciowym typem sporulacji. Sekwencjonowanie locus MAT regulującego rozmnażanie płciowe mogłoby wskazać, czy morfy płciowe u tych gatunków są nieobecne czy stłumione.

Odchody zwierzęce, rozkładająca się materia roślinna i gleba są znanymi naturalnymi siedliskami dla gatunków Chaetomium, Subramaniula i Papulaspora. De Hoog et al. (2013b) zauważyli, że rodzaj Madurella jest zagnieżdżony w Chaetomium i że wiele gatunków w Chaetomiaceae łączy asocjację z obornikiem z jałowymi warunkami klimatycznymi. Po dodaniu do Chaetomium wcześniej niezidentyfikowanych gatunków nieascosporulujących, rola tego rodzaju w chorobach ludzi i zwierząt znacznie wzrosła. Zakażenia Chaetomium oraz zakażenia gatunkami grupującymi się w drzewie filogenetycznym Chaetomium, takimi jak Chaetomidium i Thielavia, zostały zgłoszone ze skóry, włosów i paznokci (Hubka i wsp. 2011; Kaliamurthy i wsp. 2011; Najafzadeh i wsp. 2014; Vinod Mootha i wsp. 2012). Ponadto, kilka gatunków z Chaetomiaceae zostało zgłoszonych jako powodujące poważne zakażenia oportunistyczne u pacjentów z obniżoną odpornością (Al-Aidaroos et al. 2007; Guppy et al. 1998; Hoppin et al. 1983). Opisano kilka przypadków zapalenia otrzewnej podobnych do opisywanego przez nas w przypadku C. anamorphosum u osób z obniżoną odpornością, u których do zakażenia doszło podczas dializy otrzewnowej. Febré i wsp. (1999) wyizolowali C. globosum z butelek z płynem dializacyjnym; o zapaleniu otrzewnej donosili Baer i wsp. (2013). Ciekawy przypadek opublikowany przez Issa i wsp. (2013) dotyczył zapalenia otrzewnej u immunokompetentnej kobiety z Damam w Arabii Saudyjskiej, wywołanego przez nieznany gatunek Chaetomium. Najwyraźniej również osoby immunokompetentne są narażone na głębokie zakażenia Chaetomium lub grzybami pokrewnymi. Jako przykład można podać przypadek śmiertelnej feohyfomikozy mózgu wywołanej przez Thielavia subthermophila u osób z prawidłową odpornością (Badali et al. 2011). Chaetomium atrobrunneum, C. perlucidum i C. strumarium zostały uznane za gatunki neurotropowe, powodujące poważne i zagrażające życiu infekcje (Abbott et al. 1995; Barron et al. 2003; Guppy et al. 1998). Wydaje się, że członkowie Chaetomiaceae rzeczywiście mają niedoceniany potencjał kliniczny, a ponowna ocena roli rodzaju w patologii człowieka jest pilnie potrzebna. Naturalne siedliska wielu gatunków w klimacie suchym i ich zdolność do przetrwania w wysokich temperaturach prawdopodobnie zwiększają ich przeżywalność w tkankach ssaków. Zdolność C. anamorphosum do optymalnego wzrostu w temperaturze 36 °C, w przeciwieństwie do C. irregulare, jest dobrym przykładem. Gatunki te są w stanie przełamać termiczną strefę wykluczenia ludzkiego ciała i w przypadku immunosupresji lub innych problemów immunologicznych grzyby mogą stać się potencjalnymi patogenami człowieka (Casadevall 2012).

Z powodu trudności w identyfikacji na podstawie kryteriów fenotypowych, niektóre starsze przypadki gatunków Chaetomium lub Subramaniula mogły zostać błędnie zlekceważone lub zgłoszone jako przypadki infekcji Madurella lub Papulaspora (Mohd-Tahir et al. 2012). Nasze badania wyraźnie pokazują, że urazowe i oportunistyczne infekcje przez gatunki chaetomium-like często dają w hodowli szczepy nie lub słabo sporulujące (Najafzadeh et al. 2014; Vinod Mootha et al. 2012). Opisanie tych szczepów jako odrębnych jednostek taksonomicznych w rodzaju jest istotne zarówno z klinicznego, jak i epidemiologicznego punktu widzenia. Ponadto, badania wrażliwości na leki przeciwgrzybicze są skąpe, a protokoły leczenia są pilnie potrzebne.

.