(a)

(b)

(a)
(b)

Figura 1

Trattamento con succo di frutta noni ed esito della malattia. I topi C57BL/6 sono stati esposti a destrano solfato di sodio (DSS) 2,5% e trattati quotidianamente con succo di frutta noni. Il giorno 9, i topi sono stati eutanasia per ottenere sezioni intestinali. (a) Percentuale di cambiamento del peso. (b) Punteggio di malattia clinica. Salina, topi di controllo sani trattati con soluzione salina; DSS 2.5%, topi esposti a DSS; DSS 2.5% + noni puro, topi esposti a DSS e trattati con il succo di frutta noni puro; DSS 2.5% + noni 1 : 10, topi esposti alla DSS e trattati con una diluizione 1 : 10 del succo di frutta; e DSS 2.5% + noni 1 : 100, topi esposti alla DSS e trattati con una diluizione 1 : 100 del succo di frutta.

3.2. Il consumo di succo di frutta Noni inibisce l’infiammazione e preserva l’architettura intestinale in modo dose-dipendente

Dopo di che, poiché nessun effetto macroscopico è stato osservato dopo il trattamento con il succo di frutta Noni, abbiamo voluto determinare se il consumo di succo di frutta aveva qualche effetto microscopico sull’architettura intestinale. Si è osservato, in modo dose-dipendente, che il gruppo trattato con succo di frutta noni era in grado di preservare la propria architettura intestinale. I topi sani (Figura 2(a)) avevano la superficie dell’epitelio conservata, cripte rettilinee, composte da un numero abituale di cellule calice. Nella lamina propria, il solito infiltrato mononucleare era visualizzato. La sottomucosa, i muscoli e le sierose avevano un’architettura normale. I topi esposti al DSS avevano erosioni sulla superficie dell’epitelio intestinale e assenza di cripte (Tabella 1). La lamina propria ha mostrato edema moderato e infiltrazione di cellule mononucleari (Figura 2 (b), punta di freccia), la sottomucosa aveva moderato infiltrato mononucleare e grave edema (Figura 2 (b), freccia), e lo strato muscolare era leggermente ispessito, con attività di colite. Nei topi esposti a DSS e trattati con puro succo di noni, cripte irregolarità erano scarse e lievi (Tabella 1), e la lamina propria aveva moderato edema (Figura 2 (c), freccia) e infiltrato mononucleare (Figura 2 (c), punta di freccia), tuttavia, solo un lieve infiltrato mononucleare ed edema moderato sono stati rilevati nello strato sottomucoso, e lo strato muscolare era leggermente ispessito. D’altra parte, nei topi trattati con succo di frutta noni diluito 1 : 10, le cripte avevano le loro irregolarità conservate (Figura 2(d), asterisco), la lamina propria mostrava sia edema moderato (Figura 2(d), freccia) che infiltrato mononucleare (Figura 2(d), punta di freccia), e la sottomucosa aveva solo un lieve infiltrato mononucleare e un edema moderato (Tabella 1). Nei topi trattati con succo di frutta noni diluito 1 : 100, le cripte erano irregolari e atrofiche (Figura 2(e), asterisco), la lamina propria aveva edema moderato e infiltrato mononucleare, e lo strato sottomucoso mostrava un lieve infiltrato mononucleare e un edema moderato (Tabella 1). In generale, l’architettura delle cripte intestinali era conservata nei topi trattati con succo di frutta noni, ed era più conservata nei topi che avevano ricevuto succo di noni a diluizioni 1 : 10 e 1 : 100 rispetto a quelli trattati con noni puro o DSS.

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)

Figura 2

Il consumo di succo di frutta Noni conserva l’architettura intestinale in modo dose-modo dipendente dalla dose. Topi C57BL/6 sono stati esposti a destrano solfato sodico (DSS) 2,5% e trattati quotidianamente con succo di frutta noni. Il colon è stato raccolto il giorno 9 per l’analisi istopatologica. (a) topi sani senza colite; (b) topi esposti al DSS: lamina propria con edema moderato e infiltrazione di cellule mononucleari (punta di freccia), sottomucosa con moderato infiltrato mononucleare e grave edema (freccia); (c) topi esposti al DSS e trattati con puro succo di frutta noni: lamina propria con edema moderato (freccia) e infiltrato mononucleare (punta di freccia); (d) topi esposti a DSS e trattati con succo di frutta noni diluito 1 : 10: cripte con irregolarità conservate (asterisco); lamina propria con edema moderato (freccia) e infiltrato mononucleare (punta di freccia); (e) topi esposti a DSS e trattati con succo di frutta noni diluito 1 : 100: cripte regolari e atrofiche (asterisco); lamina propria con edema moderato (freccia) e infiltrato mononucleare (punta di freccia).

La produzione di NO era ridotta nei topi trattati con succo di frutta noni diluito 1 : 10 e 1 : 100 rispetto a quelli che hanno ricevuto noni puro o DSS (Figura 3(a)). Inoltre, indipendentemente dalla concentrazione utilizzata, i topi trattati con succo di frutta noni avevano una ridotta attività di MPO (Figura 3(b)) rispetto ai topi esposti al DSS. Anche se la perdita di peso e l’esito della malattia non sono stati influenzati dal consumo di frutta noni, l’architettura intestinale migliorata e la ridotta attività degli enzimi responsabili dell’infiammazione sono stati associati al consumo di succo di frutta in modo dose-dipendente.

(a)

(b)

(a)
(b)

Figura 3

Il consumo di succo di frutta Noni inibisce l’infiammazione riducendo le attività di ossido nitrico e mieloperossidasi. I topi C57BL/6 sono stati esposti a destrano solfato sodico (DSS) 2,5% e trattati quotidianamente con succo di frutta noni. Il giorno 9, i topi sono stati eutanasizzati per ottenere sezioni intestinali. Quantificazione della produzione intestinale di ossido nitrico (a) e mieloperossidasi (MPO) attività, espressa come picogramma per millilitro per grammo di tessuto (pg/ml/g) e come densità ottica per grammo di tessuto (nm/g di tessuto), rispettivamente. I dati sono rappresentati come media ± SEM. .

3.3. Il consumo di succo di frutta Noni riduce le citochine infiammatorie chiave nell’intestino in un modo dose-dipendente

Infine, abbiamo voluto valutare se il miglioramento dell’architettura intestinale potrebbe anche essere associato alla modulazione delle citochine chiave associate al peggioramento/protezione della malattia. I topi trattati con succo di frutta noni, indipendentemente dalla concentrazione utilizzata, hanno mostrato una ridotta produzione di citochine infiammatorie TNF-α e IFN-γ (Figure 4(a) e 4(c), rispettivamente). Una riduzione di IL-17, un’altra citochina chiave associata al peggioramento della malattia, è stata osservata solo nei topi trattati con diluizioni 1 : 10 e 1 : 100 (Figura 4(e)). Tuttavia, non ci sono state differenze nella produzione di IL-12 (Figura 4(b)), IL-4 (Figura 4(d)), IL-23 (Figura 4(f)) e IL-10 (Figura 4(g)). Presi insieme, questi risultati suggeriscono che una migliore architettura intestinale potrebbe anche essere associata alla riduzione locale di citochine infiammatorie chiave.

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(g)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)

Figura 4

Il consumo di succo di frutta Noni riduce le citochine infiammatorie chiave nell’intestino in modo dose-dipendente.modo dipendente dalla dose. Topi C57BL/6 sono stati esposti a destrano solfato sodico (DSS) 2,5% e trattati quotidianamente con succo di frutta noni. Il test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) è stato eseguito in omogenati intestinali. (a) TNF-α, (b) IL-12, (c) IFN-γ, (d) IL-17, (e) IL-23, (f) IL-4, e (g) IL-10. I risultati sono stati espressi come nanogrammi di citochina per millilitro per grammo di tessuto (ng/ml/g di tessuto), normalizzato dal peso secco del tessuto. I dati sono rappresentati come media ± SEM. .

4. Discussione

I risultati qui presentati dimostrano che il succo di frutta noni può ridurre le citochine infiammatorie chiave coinvolte nello sviluppo di infiammazione intestinale. Inoltre, il trattamento con il succo di frutta ha dimostrato di essere in grado di migliorare l’architettura intestinale, soprattutto quando è stata utilizzata la diluizione 1 : 10. Tuttavia, almeno apparentemente, non sono stati rilevati effetti sulla presentazione dei segni clinici della malattia.

Le proprietà benefiche del trattamento con succo di frutta noni nel controllo della colite sono state parzialmente attribuite a un miglioramento dell’architettura intestinale insieme a una riduzione dell’infiltrato infiammatorio. Questo scenario è stato seguito da una diminuzione dell’attività di NO (solo quando il succo di frutta noni è stato diluito 1 : 10 e 1 : 100) e MPO (a qualsiasi concentrazione). NO è un forte mediatore proinfiammatorio derivato principalmente dall’ossido nitrico sintasi inducibile (iNOS) dopo la stimolazione con endotossine batteriche e citochine infiammatorie come IL-1β, TNF-α e IFN-γ, in diversi tipi di cellule, tra cui macrofagi, neutrofili, cellule endoteliali e cellule muscolari lisce. La sovraespressione di iNOS, soprattutto nei siti mucosali, come il tratto gastrointestinale, è segnalata per essere associata allo sviluppo di malattie infiammatorie, tra cui IBD. In questo contesto, la produzione di alti livelli di NO da parte delle cellule infiltranti, come macrofagi, neutrofili e linfociti, così come dalle cellule epiteliali del colon, è stata descritta come direttamente associata al danno tissutale locale e al peggioramento della malattia nelle IBD. Questa osservazione è stata rafforzata dal fatto che la sovraespressione di iNOS indotta dalle citochine infiammatorie IL-1β, TNF-α, IFN-γ, IL-6, IL-17, e IL-23 è stata trovata nel plasma, nelle cellule mononucleate della lamina propria, e nelle cellule epiteliali del colon di pazienti IBD e topi con infiammazione intestinale, rafforzando così il ruolo dei derivati iNOS come NO, e citochine infiammatorie, nel peggioramento della malattia e risultato. Pertanto, sembra ragionevole credere che le terapie che mirano a modulare tali aspetti possano rappresentare uno strumento importante per limitare l’infiammazione e la progressione della malattia. In questo contesto, la monotropeina isolata dalle radici di Morinda officinalis, un membro della famiglia delle Rubiaceae come M. citrifolia, ha ridotto la produzione in vitro di NO nei macrofagi murini dopo stimolazione con LPS in modo dose-dipendente. Una correlazione positiva tra NO e la gravità delle IBD è stata proposta in studi clinici che descrivono la presenza di alti livelli di nitriti/nitrati nel plasma, nelle urine e nel lume dei pazienti IBD. Shin et al. hanno anche dimostrato l’attività della monotropeina quando i topi sono stati esposti al 4% di DSS per 9 giorni consecutivi. In questo caso, il trattamento è stato in grado di ridurre l’attività degli attori infiammatori COX-2 e MPO. Lo studio dell’attività MPO è un marcatore critico dell’infiltrazione dei neutrofili nella mucosa intestinale. Infatti, studi che utilizzano diversi protocolli per indurre la colite hanno dimostrato una correlazione positiva tra la determinazione dell’attività MPO e la gravità della malattia. Anche se le espressioni di COX-2 e iNOS non sono stati determinati nel nostro studio, questi risultati suggeriscono che diversi membri della famiglia Rubiaceae possono modulare l’infiammazione in modo simile, inibendo così la progressione e la gravità della colite indotta da DSS, utilizzando meccanismi analoghi. La capacità di modulare i componenti chiave dell’infiammazione con terapie che mirano a controllare l’attività di diversi tipi di cellule, come i macrofagi, oltre a ridurre la produzione di citochine e NO, come quella osservata nel nostro studio quando NFJ è stato utilizzato, rappresenta un approccio promettente per limitare la progressione dell’infiammazione in IBD. Il controllo dell’infiammazione attraverso questi meccanismi può spiegare il mantenimento dell’architettura intestinale osservato nel nostro studio quando sono state utilizzate le diluizioni 1 : 10 e 1 : 100.

I meccanismi complessi ed eterogenei associati allo sviluppo dell’infiammazione intestinale includono la genetica dell’ospite, i fattori scatenanti ambientali e i disturbi sia nella composizione del microbiota che nell’equilibrio immunitario. La gravità dell’infiammazione intestinale è associata a una maggiore produzione di citochine proinfiammatorie (ad esempio, TNF-α, IFN-γ, IL-6, IL-17 e IL-23), il che rende rilevanti le terapie che mirano a ridurre i livelli di queste citochine. Nel nostro studio, il trattamento con succo di frutta noni, in modo dose-dipendente, è stato in grado di ridurre la produzione di TNF-α, IFN-γ e IL-17 nell’intestino.

TNF-α è uno degli attori centrali nello sviluppo di infiammazione intestinale, ed è aumentato nella mucosa intestinale dei pazienti con IBD. Questa citochina ha anche un ruolo fondamentale nella produzione di NO, e aumenta la produzione di metalloproteinasi, che contribuisce alla perdita di integrità epiteliale e al peggioramento della malattia. Gli effetti del TNF-α sono mediati da due recettori, il recettore-1 del TNF (TNFR-1) e il recettore-2 del TNF (TNFR-2). Il primo può essere espresso in cellule immunitarie o non immunitarie, con conseguente attivazione di NF-κB, citotossicità e produzione di citochine infiammatorie. Nel nostro studio, il trattamento con succo di frutta noni ha ridotto notevolmente la produzione di TNF-α nell’intestino, indipendentemente dalla diluizione utilizzata. Questa modulazione potrebbe essere, almeno, in parte attribuita all’inibizione di NF-κB da parte dell’acido ascorbico e del flavonoide glicoside, che sono stati isolati dal succo di frutta noni fermentato. Tuttavia, è possibile ipotizzare che queste molecole potrebbero ridurre i livelli di TNF-α nell’intestino attraverso la downregolazione del TNFR-1. Infatti, a causa dell’importanza di questa citochina nello sviluppo e nell’aggravamento delle IBD, potrebbero essere utili le terapie che mirano a colpire il TNF-α per prevenire lo sviluppo dell’infiammazione intestinale. La somministrazione di anticorpi monoclonali contro IL-6 e TNF-α è stata in grado di ridurre la gravità della malattia e attenuare l’infiammazione intestinale nella colite indotta da DSS. Tuttavia, un numero sostanziale di pazienti perde la reattività soprattutto a causa della produzione di anticorpi anti-farmaco e accelerato clearance del farmaco, e che rafforza la necessità di nuovi approcci terapeutici volti a controllare meglio la progressione IBD e per ridurre gli effetti collaterali.

IFN-γ è una citochina proinfiammatoria prodotta da una vasta gamma di cellule, comprese le cellule T helper (cellule CD4 + T) e cellule T citotossiche (cellule CD8 + T), cellule natural killer e cellule linfoidi innate di gruppo 1. Una maggiore frequenza di cellule T CD4+ e cellule T CD8+ che producono IFN-γ è stata dimostrata nei pazienti con IBD rispetto alle loro controparti di controllo. Sia IFN-γ che TNF-α sono aumentati nella mucosa dei pazienti con IBD e agiscono sinergicamente contribuendo allo sviluppo e al mantenimento dell’infiammazione che culmina nella rottura della barriera. Queste citochine hanno dimostrato di interrompere le proteine di giunzione intercellulare in condizioni infiammatorie, che non sono osservate in aree non infiammate di tessuto malsano. Alcuni dei meccanismi alla base di questi disturbi includono l’apoptosi epiteliale e la ridotta trascrizione delle proteine di giunzione stretta. Pertanto, le terapie che mirano a ridurre questa citochina potrebbero essere utili per controllare l’infiammazione e migliorare l’esito della malattia. In questo contesto, un trattamento a breve termine con glucocorticoidi di topi esposti a DSS per sei giorni è stato in grado di ridurre la frequenza delle cellule CD4+ produttrici di IFN-γ nella milza e di diminuire l’espressione di questa citochina e di IL-1β nell’intestino. Questa riduzione dell’attività di IFN-γ è stata seguita da un miglioramento del risultato clinico e dal ripristino dell’equilibrio immunitario. Inoltre, gli effetti benefici associati alla riduzione delle citochine infiammatorie come IL-1β e IFN-γ sono stati ulteriormente chiariti in un modello murino di colite. In questo caso, la colite è stata indotta dalla somministrazione intracolonica di acido dinitrobenzene solfonico (DNBS), e i topi sono stati trattati con un cannabinoide non psicotropo, noto come cannabigerolo. Anche se gli effetti del trattamento con succo di frutta noni su apoptosi e permeabilità intestinale non sono stati indagati in questo studio, il miglioramento dell’architettura intestinale e la riduzione dell’infiltrato infiammatorio potrebbe essere in parte attribuito alla riduzione di IFN-γ.

Le cellule che producono IL-17 sono coinvolte nella patogenesi di numerose malattie infiammatorie e autoimmuni, e hanno dimostrato di mediare la patogenesi della malattia nelle IBD. Il ruolo delle cellule Th17 nella patogenesi delle IBD è stato principalmente attribuito a una mutazione nel gene IL-23R, che è stato identificato in pazienti IBD e che regola la produzione di citochine Th17-correlate. In effetti, un aumento della produzione di IL-17 da parte delle cellule della lamina propria sia nelle UC che nelle CD era già stato dimostrato. Inoltre, le citochine prodotte dalle cellule Th17, come IL-17 e IL-21, sono state trovate per upregolare l’espressione di TNF-α, IL-1β, IL-6 e IL-8 e il reclutamento di neutrofili, che possono contribuire al peggioramento IBD. Oltre al ruolo classico dei linfociti Th17 nella patogenesi delle IBD, le cellule linfoidi innate del gruppo 3 sono state anche implicate nella produzione di IL-17 e nella patogenesi della malattia sia in modelli sperimentali che in soggetti umani. Nel nostro studio, sono stati rilevati livelli ridotti di IL-17 nel colon di topi trattati con succo di frutta noni, ma solo quando sono state utilizzate le diluizioni 1 : 10 e 1 : 100. Anche se non abbiamo identificato se la riduzione di IL-17 nell’intestino era più associata all’immunità innata o adattativa, o entrambe, non possiamo sottovalutare l’importanza delle terapie che mirano a produrre queste citochine per inibire l’infiammazione nella colite.

In generale, i nostri dati hanno dimostrato che il trattamento con succo di frutta noni gioca un ruolo importante nell’inibire l’infiammazione durante lo sviluppo della colite sperimentale. Uno degli aspetti chiave dell’uso del succo di frutta come opzione terapeutica riguarda il suo effetto immunomodulatore, che ha un conseguente impatto sul miglioramento dell’architettura intestinale. Tuttavia, ulteriori studi devono essere eseguiti per chiarire le molecole alla base della riduzione delle citochine infiammatorie in questo modello.

Interessi concorrenti

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Riconoscimenti

Questo studio è stato sostenuto dalla Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), e Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, 150075/2016-2).