Participantes humanos

Experimentos em Espanha foram revisados e aprovados pelo Comitê de Ética do Hospital Universitário La Fe Valencia e aderiram aos princípios da Declaração de Helsinque e outras revisões. As experiências em Berlim foram aprovadas pelo Comitê de Ética da Charité-Universitätsmedizin, Berlim (EA4/012/05). Foram estudadas duas coortes: uma constituída por 65 voluntários adultos saudáveis e uma de 16 pacientes com síndrome de Usher (tipo II) portadores de diferentes mutações de truncagem no USH2A. Os dados de três pacientes foram omitidos do presente estudo devido a dois pacientes com diagnóstico prévio de diabetes e um paciente com síndrome do túnel do carpo, o que poderia afetar os limiares psicofísicos. Os participantes do estudo foram testados com uma bateria constituída por nove testes psicofísicos aplicados à pele. Todos os participantes receberam informações escritas e orais antes de participar do estudo e deram o seu consentimento por escrito. Nenhum dos participantes do estudo tinha idade <20 anos. As seguintes informações dos participantes foram documentadas: idade, sexo, mão, aparelhos auditivos (aparelhos auditivos, implantes cocleares), gravidade dos sintomas de surdez e cegueira e comorbidades.

Testes sensoriais quantitativos humanos

Testes psicofísicos foram realizados de acordo com o protocolo de teste padronizado do teste sensorial quantitativo da Rede Alemã de Pesquisa sobre Dor Neuropática44. Os limiares perceptuais vibrotáteis em diferentes frequências foram determinados através de um ensaio de duas escolhas1,2. O dispositivo foi composto de um atuador piezo linear (Physik Instrumente, catálogo nº P-602.1 L), cujos deslocamentos são acionados e controlados por um amplificador/controlador (Physik Instrumente, catálogo nº E-665). Os sinais foram processados pelo sistema de aquisição de dados PowerLab (PowerLab 4/35, ADInstruments). O estímulo de vibração tinha 1,8 s de comprimento e os tempos de subida e descida no início e offset eram de 500 e 600 ms, respectivamente, independentemente da frequência ou amplitude de teste. A duração do estímulo entre as fases de ativação e de deslocamento foi de 700 ms. Foi empregado um conjunto de estímulos de vibração que escalou logaritmicamente entre 18 nm e 45 μm. Para os testes de vibração 10-Hz e 125-Hz, a amplitude inicial foi ajustada para 7,18 μm e 2,84 μm, respectivamente. Não medimos diretamente o movimento da sonda sob as condições de teste utilizadas. Este atuador piezoelétrico mostra alta fidelidade, mas a atenuação da amplitude poderia teoricamente ocorrer com deslocamentos de maior amplitude próximos à amplitude máxima de curso do atuador (35 µm). No entanto, todos os participantes apresentaram limiares psicofísicos bem abaixo dos 35 µm para todas as frequências testadas (Fig. 1c). Observe que exatamente o mesmo aparelho foi usado para medição em controles saudáveis e participantes com síndrome de Usher. Os estímulos mecânicos de vibração foram entregues à pele entre a unha e a primeira articulação do dedo mindinho. A sonda foi feita de vidro e tinha uma área de contato circular de 5 mm de diâmetro, plana, com um contrapeso de latão para garantir que o mesmo grau de força de retenção fosse aplicado em cada participante. O dedo mindinho da mão dominante foi testado em duas frequências (10 Hz e 125 Hz; duração 1,8-s). Os participantes sinalizaram a detecção de um estímulo vibratório durante uma das duas janelas de tempo, pressionando um botão. O protocolo consistiu de um desenho ascendente para baixo que aumentou ou diminuiu a amplitude do estímulo (entre 18 nm e 45 µm), dependendo da taxa de sucesso durante a tarefa. Foram realizadas oito inversões de amplitude ascendentes (um total de ~40-80 ensaios individuais por sessão) em torno do limiar perceptual para criar um limiar perceptual médio para cada paciente. A amplitude dos estímulos de vibração impulsionados pelo dispositivo piezo foi calibrada medindo a amplitude de deslocamento da sonda sob um microscópio para escalonar os incrementos de tensão.

Um teste de acuidade tátil também foi utilizado para testar os limites de resolução espacial da ponta do dedo (inervação mediana), utilizando um teste de orientação de grade tátil de dois intervalos, de escolha forçada, com um cubo de acuidade tátil, que consistiu de seis lados com grades de diferentes larguras (0,75, 1,25, 1,75, 3,0, 4,5 e 6,0mm)1,2,3. Os participantes foram vendados e o cubo foi colocado na orientação vertical ou horizontal contra a ponta dos dedos. Foi utilizado um procedimento de dois para baixo e um para cima com pontos de viragem de 10-15 mm. Os limiares (71% de resposta correta) foram calculados como mediana dos últimos 10 dos 15 pontos de virada2. Os limiares de detecção mecânica foram determinados usando um conjunto padronizado de 23 filamentos vFh (Optihair3-Set) com forças entre 0,25 e 265 mN. Os VFhs foram aplicados em ordem ascendente no aspecto dorsal da mão (inervação radial) durante 1 s até que o participante percebesse uma sensação tátil. A ordem foi então invertida até o ponto em que o participante não percebeu uma sensação táctil. A força média de cinco reversões foi tomada como limiar. Os limiares mecânicos de dor foram testados com um conjunto de sete estimuladores de pinprick ponderados (Sistemas MRC) com pontas de 0,25 mm e forças entre 8 e 512 mN. Um método simples de escada (regra de um para cima e um para baixo) foi realizado onde foi perguntado aos pacientes se o estímulo era percebido como a agudeza que causava a sensação de picada de dor. Os estímulos foram aplicados ao aspecto dorsal da mão após tarefas de detecção de vFh. O limiar foi calculado a partir da média de cinco reversões. Os limiares de percepção térmica quente e fria e os limiares de dor quente e fria foram testados utilizando um analisador termosensorial TSA II (MEDOC). O termóstato tinha uma área de 9 cm2, temperaturas de corte entre 0 e 50 °C, e uma taxa de mudança de temperatura de 1 °C s-1. O termodo foi colocado sobre o aspecto volar da região do meio da fazenda (inervação antebraquial medial). Foram realizados três ensaios consecutivos para cada ensaio térmico na seguinte ordem: detecção de frio, detecção de calor e limiares de dor fria e de dor térmica. Foi pedido aos participantes do estudo que indicassem em que ponto começaram a sentir frio, aquecimento, dor de frio e calor. Os limiares foram a temperatura média dos três ensaios em cada teste.

Ratos

Todos os ensaios foram aprovados pelo Comité de Ética Animal de Berlim (Landesamt für Gesundheit und Soziales) e realizados de acordo com a lei europeia de bem-estar animal. Foram utilizados machos e fêmeas Ush2a-/- ratos e companheiros de ninhada do tipo selvagem (Ush2a+/+) de origem CBA/CaJ com idade entre 10 e 30 semanas11. Todos os experimentos anatômicos e eletrofisiológicos foram realizados em número aproximadamente igual de ratos fêmeas ou machos. Para a tarefa de detecção de vibração foram utilizados apenas ratos fêmeas. Todos os camundongos foram mantidos em um ciclo de 12 h claro:12 h escuro.

Anatomia do tecido do rato e imunohistoquímica

Para imunohistoquímica da pele, os camundongos foram eutanizados por inalação de CO2 por 2-4 min seguido por deslocamento cervical, e o tecido cutâneo da pata foi dissecado e a hipoderme, ligamentos e tecido muscular ligado foram removidos. As amostras de pele foram esticadas usando pinos de insecto e fixadas por 45 min em paraformaldeído a 4% (PFA). Para cortes de vibratoma de gelatina, as amostras de tecido foram colocadas em moldes embutidos (Polysciences, T-8), preenchidos com gelatina quente (20%, dissolvida em solução salina tampão fosfato 0,1 M (PBS)), e pós-fixadas em PFA 4% durante a noite a 4 °C antes de cortes de 120µm serem cortados usando um vibratoma (Leica, VT100S). Para a coloração integral, as amostras de pele foram esticadas durante 2 h em PFA, depois fixadas em 4 °C durante 24 h em 20% de dimetilsulfóxido e 80% de metanol. Após o corte ou pós-fixação, as amostras de tecido foram lavadas três vezes em PBS (0,1 M) e incubadas durante 72 h a 4 °C em solução de bloqueio e anticorpos primários. As amostras foram então lavadas três vezes em PBS antes de 24 h de incubação (4 °C) com anticorpos secundários diluídos em solução de bloqueio. O tecido foi então novamente lavado três vezes, e processado para a limpeza do tecido usando 2,2′-iodietanol (TDE, Sigma-Aldrich). As seções foram colocadas em concentrações crescentes de TDE a cada 2 h, de 10% a 25%, 50% e 97%, nas quais as amostras foram armazenadas e montadas em lâminas e tampa deslizante.

Anticorpos policlonais visando Ush2A foram gerados no coelho pela Eurogentec. Foram criados quatro anticorpos que se ligam a diferentes epitopos de ligação no N- e C-termini do Ush2A (N-terminus: anticorpo 1, CSPLYNDKPFRSGDNV e anticorpo 2, C+SWEKPAENFTRGEII; C-terminus: anticorpo 1, C+ADTRLPRSGTPMSIR e anticorpo 2, CIRERPPLVPLQKRMT), e foram purificados a partir de anti-soros antes do uso. Os quatro anticorpos foram utilizados em conjunto (1:200) para protocolos de coloração em colorações sequenciais com o anti-NF200 (Millipore, 1:1.000) de galinha, anti-S100 (Dako, 1:1.000) de coelho ou anti-CK20 de cobaia (Origene Tech, 1:200). Os anticorpos secundários utilizados foram o anti-coelho Alexa Fluor 488 (Invitrogen,1:800), o anti- galinha Alexa Fluor 647 (Invitrogen 1:800), o anti- rato Alexa Fluor 633 (Invitrogen, 1:800), o anti-coelho Alexa Fluor 647 (Invitrogen 1:800) e o anti-guinea-pig Alexa Fluor 647 (Invitrogen, 1:800). As imagens em mosaico z foram obtidas usando um microscópio confocal (Carl-Zeiss, catálogo nº LSM700) usando o software Zen2009. Os corpúsculos e folículos capilares de Meissner foram visualizados e contados usando o programa Fiji/ImageJ. Para imagens de microscopia eletrônica do nervo ciático, os animais foram perfurados e o nervo ciático foi dissecado e fixado em PFA 4% e glutaraldeído 2,5%, e contrastado com tetroxido de ósmio antes de ser incorporado à resina Technovit 7100 (Heraeus Kulzer). Os cortes ultrafinos foram capturados com magnificação de 5.600×. Fibras nervosas mielinizadas e fibras não mielinizadas foram contadas e medidas usando o software Fiji/ImageJ.

Reprodutibilidade

Todos os experimentos imunohistoquímicos e imagens capturadas foram repetidas em várias coortes de ratos em dias diferentes, e nenhuma imagem foi tirada de um único indivíduo que não pudesse ser reproduzida. Imagens de microscopia eletrônica foram obtidas de diferentes literatos em uma única execução experimental.

Preparo do nervo cutâneo do rato e registros sensoriais aferentes

Registros de fibras sensoriais cutâneas foram feitos usando o preparo ex vivo do nervo cutâneo. Os ratos foram eutanizados por inalação de CO2 durante 2-4 min, seguida de luxação cervical. Três preparações diferentes foram realizadas em experimentos separados usando diferentes regiões de pata: o nervo safeno inervando a pele do retropé peludo21; o nervo tibial inervando a pele do retropé glabro; e os nervos medial e ulnar inervando a pele do retropé glabro20. Em todas as preparações, a pele peluda do membro foi raspada e a pele e o nervo foram dissecados livres e transferidos para a câmara de registro, onde os tecidos muscular, ósseo e tendinoso foram removidos da pele para melhorar a qualidade do registro. A câmara de registro foi perfused com um fluido intersticial sintético a 32 °C: 123 mM NaCl, 3,5 mM KCl, 0,7 mM MgSO4, 1,7 mM NaH2PO4, 2,0 mM CaCl2, 9,5 mM gluconato de sódio, 5,5 mM glicose, 7,5 mM sacarose e 10 mM ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazina-etanossulfônico (Hepes), pH 7,4. A pele foi pinçada e esticada, de modo que o exterior da pele pudesse ser estimulado por meio de sondas estimuladoras. O nervo periférico foi alimentado através de uma câmara adjacente em óleo mineral, onde filamentos finos foram arrancados do nervo e colocados em um eletrodo de registro de fios de prata.

Os campos receptivos de mecanorreceptores individuais foram identificados por meio da sondagem mecânica da superfície da pele com uma haste de vidro romba ou pinça romba. A saída analógica de um amplificador Neurolog foi filtrada e digitalizada utilizando o sistema Powerlab 4/30 e o software Labchart 7.1 (ADinstruments). A extensão de histograma de picos para Labchart 7.1 foi usada para classificar picos de unidades individuais. Os estímulos elétricos (1 Hz, pulsos quadrados de 50-500 ms) foram entregues em campos receptivos de uma unidade para medir a velocidade de condução e permitir a classificação como fibras C (velocidade <1,2 m s-1), Aδ-fibras (1,2-10 m s-1) ou Aβ-fibras (>10 m s-1). A estimulação mecânica dos campos receptivos dos neurônios foi realizada usando um atuador piezo (Physik Instrumente, catálogo nº P-841.60) e um Nanomotor de duas extremidades (Kleindiek Nanotechnik, catálogo nº MM-NM3108) conectado a um dispositivo de medição de força (Kleindiek Nanotechnik, catálogo nº PL-FMS-LS). As medições de força calibradas foram adquiridas simultaneamente usando o sistema Powerlab e o software Labchart durante o experimento (Dados Estendidos Fig. 10).

Como diferentes tipos de fibras têm diferentes propriedades de afinação de estímulos, diferentes protocolos de estímulos mecânicos foram usados com base no tipo de unidade. Fibras de baixo limiar Aβ (RAMs e SAMs) e Aδ-fiber D-hairs foram estimuladas com o atuador piezo com três estímulos de vibração (5 Hz, 25 Hz e 50 Hz, distorções introduzidas pelo sensor de força in-series impedidas usando freqüências >50 Hz) com amplitude crescente em seis passos (amplitudes de pico a pico de ~6-65 mN; 20 ciclos por passo), e uma sequência de estímulos dinâmicos com quatro formas de onda de rampa e retenção com velocidades de deflexão da sonda variáveis (3 s de duração; 0.075, 0,15, 0,45 e 1,5 mm s-1; amplitude média 100 mN). Aβ – SAMs e RAMs de fibra foram classificados pela presença ou ausência de disparo durante a fase estática de um estímulo de rampa e retenção, respectivamente, como descrito anteriormente20,21. Unidades individuais foram estimuladas adicionalmente com uma série de cinco estímulos mecânicos estáticos com formas de onda em rampa e retenção de amplitude crescente (3 s de duração; variando de ~10 mN a 260 mN). SAMs de baixo limiar, SAMs de alto limiar Aδ-fibras e C-fibras também foram estimuladas usando o nanomotor com cinco estímulos de rampa e retenção com amplitudes crescentes20,

Registros de unidades únicas de aferentes pacinianos

Para avaliar a mechanosensibilidade dos corpúsculos pacinianos localizados ao redor da fíbula, a pele e todos os músculos foram removidos da perna inferior e o nervo interósseo foi dissecado livre da membrana interóssea. Posteriormente, a fíbula e a tíbia, que em ratos são fundidas ao longo de sua metade distal, foram removidas do animal, juntamente com o nervo interósseo, e foram transferidas para uma câmara de banho de órgãos personalizada, onde foram montadas usando um mini-vice personalizado. Todo o procedimento de dissecção foi realizado em tampão de dissecção gelado que continha 108 mM N-metil-d-glucamina, 20 mM Hepes, 3,5 mM KCl, 10 mM MgSO4, 26 mM NaHCO3, 1,7 mM NaH2PO4, 9,5 mM gluconato de sódio, 5,5 mM glicose, 18,5 mM sacarose e 0,5 mM CaCl2 (ajustado para pH 7,4 com NaOH). Após um período de recuperação de 10 min, o preparo foi perfused com tampão de registro oxigenado (35 °C), que consistiu de 108 mM NaCl, 3,5 mM KCl, 0.7 mM MgSO4, 26 mM NaHCO3, 1,7 mM NaH2PO4, 9,5 mM gluconato de sódio, 5,5 mM glicose, 7,5 mM sacarose e 1,5 mM CaCl2 (ajustado ao pH 7,4 com NaOH), e a extremidade proximal do nervo interósseo foi transferida para uma câmara de registro cheia de óleo, enfiando-a através de um pequeno orifício (~1 mm de diâmetro) que conectou a câmara do banho de órgãos com a câmara de registro adjacente. Após a remoção do perineurium, filamentos simples foram dissecados livres e fixados ao eletrodo de registro para o registro do potencial de ação. As gravações foram feitas com o sistema Neurolog (Digitimer Ltd, catálogo nos. NL100AK e NL104A) e um PowerLab 4SP controlado pelo LabChart 7.1 (Instrumentos AD). Para determinar o limiar de ativação mecânica e o ajuste de freqüência dos aferentes Pacinian, uma série de estímulos mecânicos sinusoidais (duração 1 s; amplitude linearmente crescente úmida/dt = 30 µm s-1; amplitude máxima 30 µm) com freqüência crescente (40-480 Hz) foi aplicada na extremidade distal da fíbula com uma haste metálica (diâmetro da ponta 1 mm) que foi fixada a um atuador piezoidal (Physik Instrumente GmbH, catálogo nº. P-840.2).

Tarefa de aprendizagem de percepção de vibração do rato

Primeiro, para implantação do apoio de cabeça, os ratos foram anestesiados com isoflurano (1,5-2% em O2) e injetados subcutaneamente com metamizol (200 mg por kg de peso corporal). Um suporte metálico leve foi implantado no crânio com cola (mossa UHU) e cimento dental (Paladur). A temperatura dos ratos foi monitorizada com uma sonda rectal e mantida a 37 °C utilizando uma almofada de aquecimento. Os ratos foram então colocados na sua gaiola doméstica com metamizol (200 mg ml-1) na água potável. Os ratos implantados foram habituados a um encosto de cabeça 3-5 d após a cirurgia. Os camundongos foram gradualmente habituados no ajuste comportamental para fixação da cabeça. Em seguida, 1 d após o início da restrição da água, os ratos foram submetidos a duas sessões de emparelhamento em dias consecutivos.

Sessões de emparelhamento (30 a 45 minutos de duração), recompensas de água foram dadas a partir de um jato de água emparelhado com a apresentação do estímulo vibratório (3 s de duração, 5 Hz, 60 mN) para a pele glabra da papa dianteira para construir uma associação entre estímulo e recompensa. O estímulo de vibração foi dado à pata através de uma haste de vidro almofadada personalizada de 2-mm2 fixada a um atuador piezo (PICMA da Physik Instrumente, catálogo nº PL127.11). Uma relação tensão-força foi calibrada usando um sistema de medição de força (Dual-Mode Lever Arm system 300-C, Aurora Scientific) para medir o perfil de força sinusoidal aplicada pelo dispositivo piezoidal após cada experimento. O atuador piezoeléctrico de flexão utilizado pode ter acrescentado algum ruído harmónico em comparação com outros sistemas piezoeléctricos empilhados. Entretanto, a calibração do piezo em cada experimento garantiu que os déficits substanciais na percepção táctil dos ratos Ush2a-deficientes fosse improvável que fosse um artefacto técnico.

Após o emparelhamento, iniciaram-se sessões diárias de treino durante as quais os ratos receberam uma pequena recompensa de água (4-7 μl) do bico quando lamberam correctamente durante uma janela de oportunidade no início do estímulo (3,5 s). As provas de captura, onde não foi apresentado nenhum estímulo e as lambidas foram contadas como falsos alarmes, foram intercaladas como 50% do total das provas. As tentativas não foram cortadas por nenhum evento ou estímulo externo como descrito anteriormente10 e foram entregues em intervalos de tempo aleatórios entre 3 e 30 s. Se os ratos lambessem durante uma janela de 2 s antes do início do estímulo, um atraso de 3 a 30 s era imposto para promover a associação estímulo-água recompensa. Uma sessão de treino consistiu em cerca de 60 tentativas (30× estímulo + 30× captura). As taxas de acertos e falsos alarmes foram comparadas para avaliar o desempenho durante as sessões de treinamento. Para testar que ratos estavam lambendo em resposta ao estímulo de vibração da pata dianteira, uma sessão foi incluída no final do treinamento, na qual o dispositivo estimulante foi movido 3-5 mm abaixo da pata, de modo que não foi feito contato com a pele. Em dias experimentais subsequentes, após os ratos terem aprendido a tarefa com sucesso, foram dados estímulos de vibração com amplitudes e frequências diferentes. Para vibração 5-Hz, forças de 48 mN, 36 mN, 24 mN, 12 mN e 6 mN foram usadas para estimular a pata dianteira, com duas amplitudes diferentes intercaladas com ensaios de captura durante cada dia. Por exemplo, os estímulos de 48 mN e 24 mN e os ensaios de captura foram intercalados durante uma sessão, que consistiu em cerca de 100 ensaios (estímulo de 33× 48 mN + 33× 24 mN + 34× captura). Os estímulos de 6-mN foram testados durante duas sessões. Para as vibrações de 25-Hz e 125-Hz, forças de 60-mN e 12-mN da mesma frequência foram intercaladas com tentativas de captura da mesma forma durante duas sessões de teste.

Ensaio comportamental de inibição de pulsos emparelhados do rato

A resposta de arranque de ratos foi avaliada usando o sistema Startle Response (SR-LAB, San Diego Instruments). Os ratos foram habituados ao aparelho durante 30 minutos por dia durante 3 d antes dos testes. Resumidamente, as respostas de startle dos ratos foram medidas em um total de 48 ensaios de pulso individual45 (40 ms de duração, 129 dB) e ensaios de pré-pulso + pulso (20 ms de pré-pulso de 69, 73 ou 81 dB). Os ensaios de pré-pulso foram 200 ms antes dos ensaios de pulso. A porcentagem de inibição de pulso pareado (% PPI) para cada intensidade de pré-pulso foi calculada como %PPI = 100 × ((pulso sozinho) – (pré-pulso + pulso))/pulso sozinho.

Mouse vFh e ensaios de comportamento de escova

Ratos foram habituados ao ambiente de teste durante 30 minutos por dia durante 3 d antes do teste. Nos dias experimentais, os ratos foram colocados em cubículos individuais de Plexiglas em uma plataforma de malha elevada. Para o ensaio com pincel, o retro-pintor esquerdo foi afagado do calcanhar aos pés com um pincel de 2 mm de cabeça 10× em intervalos aleatórios. A percentagem de retiradas foi calculada. Em dias de teste subsequentes, foram medidos limiares de retirada mecânicos nocivos utilizando vFhs. Resumidamente, as superfícies plantares retroescavadas esquerdas foram estimuladas com filamentos vFh e o limiar de reflexo foi determinado usando o método ascendente para baixo46. Dependendo da resposta do animal, foram aplicadas vFhs de maior ou menor força no retropaciente para estabelecer uma série de seis a nove retiradas de reflexos positivos ou negativos. Esse padrão de respostas foi então convertido de tal forma que os dados foram expressos como o log da média do limiar de 50% de retirada do reflexo46,

Análise dos dados de psicofísica humana

Dados foram testados para normalidade, e as diferenças de desempenho psicofísico para cada teste entre os participantes do controle e os pacientes com síndrome de Usher foram comparados usando os testes t de Student não pareados ou os testes U de Mann-Whitney. As transformações z foram usadas para comparar perfis de dados individuais individuais com a média e a d.s. de controle saudável. O z-score foi calculado usando planilhas do Excel com base na fórmula z = (escore do paciente – média do grupo por s.d. da média do grupo). Os valores z >0 indicam ganho de função, significando que o participante é mais sensível aos estímulos testados em comparação com os controles saudáveis. Podem ser identificados z-scores individuais fora do intervalo de confiança de 95% (ou seja, z-score <1,96 ou >1,96 s.d.) do conjunto de dados do controle saudável. O desempenho em cada teste foi testado em comparações em pares usando o teste Mann-Whitney U e consideramos P < 0,01 como estatisticamente significativo.

Análise de dados do comportamento de vibração do rato

Licks foram registados com um sensor na ponta do bico de recompensa da água. Em testes de estímulo, uma batida foi contada quando houve uma lambida dentro da janela de oportunidade (3,5 s) após o início do estímulo. Dados comportamentais foram coletados usando rotinas personalizadas no Lab View a uma taxa de amostragem de 1 kHz, e scripts Python personalizados foram usados para análise. Durante os testes de captura, um falso alarme ocorreu quando houve uma lambida durante uma janela de oportunidade igualmente longa. Para avaliar se os ratos aprenderam a tarefa de detecção com sucesso, foram comparadas taxas de acertos com taxas de falsos alarmes dentro da mesma sessão de treinamento, usando a análise de variância (ANOVA) de medidas repetidas de duas vias com os testes post-hoc de Bonferroni.

Para quantificar o desempenho nas tarefas de detecção, usamos d’ (índice de sensibilidade) em vez da porcentagem de testes corretos para levar em conta o viés nos critérios de lambedura47. Para calcular d’, foi utilizada a seguinte fórmula: d’ = z(h) – z(fa), onde z(h) e z(fa) são o inverso normal da função de distribuição cumulativa das taxas de acerto e falso alarme, respectivamente. Para evitar infinitos valores de d’, quando todas as tentativas foram relatadas (taxa = 1) ou nenhuma foi (taxa = 0), as taxas foram substituídas por (1½N) ou (½ N), respectivamente, onde N é o número de tentativas em que o estímulo foi apresentado48. Os z-scores para as taxas de acertos e falsos alarmes foram calculados usando OpenOffice Calc (Apache Software Foundation) com a função NORMINV. Realizamos testes estatísticos sobre dados apenas onde pelo menos um dos genótipos mostra d’ > 1,0, indicando que estes ratos reportaram o estímulo. Os dados comportamentais foram coletados usando rotinas personalizadas no Lab View a uma taxa de amostragem de 1kHz, e scripts Python personalizados foram usados para análise. Os códigos e scripts personalizados estão disponíveis mediante solicitação; mais informações estão disponíveis no Nature Research Reporting Summary associado a este manuscrito.

Comportamentos de lambida foram calculados e plotados como probabilidade de lambida, frequência da primeira lambida (Hz) ou latência média da primeira lambida (s). Estas medidas foram calculadas da seguinte forma: a probabilidade de lick é a probabilidade de um rato lamber pelo menos uma vez durante a janela de oportunidade num estímulo ou tentativa de catch trial (tentativas com pelo menos 1 lick/total de tentativas). Nos PSTHs das primeiras lambidas mostramos a distribuição binária das latências das primeiras lambidas em estímulos ou tentativas de captura. Para normalizar estes dados em ratos, dividimos o número de primeiras lambidas pelo número total de tentativas. Dividindo o valor da primeira lambida pela largura do bin, calculamos o valor em hertz (lambidas por s). A média da latência da primeira lambida (s) foi calculada pela soma das latências da primeira lambida em cada tentativa de sucesso e dividindo pelo número total de tentativas.

Análise dos dados dos registros de preparação de pele-nervos

Unidades forepaw e hindpaw foram categorizadas com base na sua velocidade de condução e respostas a estímulos mecânicos. Os limiares mecânicos das unidades foram calculados como a temperatura ou a amplitude mecânica necessária para eliciar o primeiro potencial de ação. Todas as análises estatísticas foram realizadas usando GraphPad Prism 6.0 e Python. Os testes estatísticos incluem ANOVAs de medidas repetidas de duas vias com o teste post-hoc de Bonferroni, testes t de Student, testes U de Mann-Whitney e os testes de par combinado de Wilcoxon. Os testes de Kolmogorov-Smirnov foram usados para avaliar a normalidade dos dados. Os asteriscos em números indicam significância estatística: *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001.

Análise de dados da microscopia eletrônica do nervo ciático do rato

Para análise das micrografias eletrônicas do nervo ciático do rato, o número de fibras mielinadas e não mielinadas foi contado em 12 seções por nervo. O número total de fibras por nervo foi então extrapolado a partir da área da seção transversal de cada nervo.

Resumo do relatório

Outras informações sobre o desenho da pesquisa estão disponíveis no Nature Research Reporting Summary ligado a este artigo.