Leishmaniose canina (CanL) é uma infecção/doença protozoária causada por Leishmania infantum (sinônimos: Leishmania chagasi; Leishmania infantum chagasi) altamente prevalente em todos os países do Mediterrâneo, regiões caucasianas e do Oriente Médio do Velho Mundo, bem como em vários territórios latino-americanos (Dantas-Torres et al., 2012). Os resultados da infecção em cães variam de subclínica a clínica, e de doença leve a grave. Embora o parasita possa ocasionalmente ser transmitido por modos não vetoriais (EFSA Panel on Animal Health and Welfare, 2015), a principal via de transmissão é através da picada de moscas-areias flebotominas infectadas. A partir de cerca de 7 dias após uma refeição de sangue infectada, os vectores competentes podem desenvolver promastigotas Leishmania infecciosas no primeiro plano, que são regurgitadas na pele do hospedeiro mamífero durante a refeição de sangue subsequente (Bates, 2007). Tanto os cães subclínicos como os doentes podem ser infecciosos para os vectores; no entanto, a probabilidade de contribuir desproporcionalmente para a transmissão posterior (efeito “super-spreader”) aumenta com a duração e gravidade do CanL (Courtenay et al., 2014).

Phlebotomus perniciosus é o principal vector competente de L. infantum em toda a bacia ocidental do Mediterrâneo, incluindo a Europa meridional e o noroeste de África (Centro Europeu de Prevenção e Controlo de Doenças, 2019). Além disso, P. perniciosus é um membro representativo de um grupo taxonómico maior, o subgénero Larroussius, constituído por espécies morfologicamente, geneticamente e biologicamente próximas, actuando como vectores competentes de L. infantum no Mediterrâneo central e oriental, tais como Phlebotomus negliglectus e Phlebotomus tobbi (Alten et al., 2016). O uso de piretróides tópicos é universalmente considerado a abordagem de primeira linha para proteger cães saudáveis das picadas de mosca da areia infectadas por Leishmania (Maroli et al., 2010), enquanto que o manejo de cães infectados/infecciosos é uma tarefa complexa devido à falta de um amplo consenso em relação à abordagem a ser adotada. Idealmente, os cuidados veterinários individuais para o manejo da patologia do CanL devem ser combinados com medidas que visem evitar que o parasita se propague através do vetor. Este último é particularmente importante como parte dos programas de controle de LVs zoonóticos atualmente realizados em vários países endêmicos. Por um lado, os proprietários estão relutantes em investir em produtos piretróides para cães já infectados ou doentes; por outro lado, as terapias antileishmânicas têm eficácia apenas temporária para reduzir consistentemente a infecciosidade de um cão às moscas da areia (Miró et al., 2017). As isoxazolinas são uma nova classe de compostos que visam o sistema nervoso central e as junções neuromusculares dos vetores artrópodes, bloqueando os canais de cloreto de liga e cloreto de sódio, causando assim a morte do artrópode (Weber & Selzer, 2016). Vários compostos foram licenciados como medicamentos veterinários para a proteção de animais de companhia contra pulgas e carrapatos, com semi-vidas longas in vivo que proporcionam semanas a meses de proteção após uma única administração oral (Kilp et al., 2014; Shoop et al., 2014). Estas propriedades chamaram a atenção para o potencial uso de isoxazolinas para o controle de doenças humanas transmitidas por vetores (Miglianico et al., 2018). Com relação aos insetos voadores, tanto o grau quanto a duração da eficácia inseticida diferiram entre os medicamentos isoxazolinas disponíveis comercialmente quando administrados em cães, como contra Triatoma infestans (Loza et al., 2017) ou a mosca da areia Phlebotomus papatasi (Gomez et al., 2018a), com o fluralaner (Bravecto®; Merck Animal Health) demonstrado ser o composto mais ativo com relação aos parâmetros de eficácia acima. Recentemente, um ensaio clínico de tratamento de fluralaner de cães contra moscas da areia fez uso de P. papatasi colonizado como espécie alvo (Gomez et al., 2018b). No entanto, esta espécie pode não ser considerada um modelo adequado de mosca da areia. Isto é principalmente porque o P. papatasi não é um vector competente de L. infantum, sendo refractário ao desenvolvimento intestinal deste parasita. Além disso, estudos anteriores sobre piretróides tópicos caninos (Maroli et al., 2010) sugerem que o P. papatasi pode ser menos susceptível a compostos que visem o sistema nervoso central da mosca da areia do que o P. perniciosus. Por exemplo, uma formulação de permetrina a 50%-10% de imidaclopride matou 29% de P. papatasi contra 49% de P. perniciosus. Estas considerações levaram-nos a determinar o início e a duração da eficácia insecticida contra o P. perniciosus após a alimentação de cães tratados com fluralaner.

Foi realizado um estudo de eficácia de um único centro, randomizado, controlado negativamente, cego e com um grupo paralelo. Cães experimentais, constituídos por Beagles macho ≥ 6 meses de idade no momento da inclusão, eram de uma colónia de pesquisa em Mohammedia, Marrocos; o estudo em fase de vida foi realizado nas instalações da Clinvet. Os exemplares de P. perniciosus adultos eram de uma estirpe espanhola mantida a partir de Junho de 2012 nas instalações de entomologia médica do Istituto Superiore di Sanità, Itália, a 28 ± 1 °C e 75-80% de humidade relativa. As moscas da areia foram certificadas como livres de patógenos e adaptadas às condições de reprodução em massa com seis sub-linhas de colónias independentes. Os espécimes de três a nove dias de idade foram reunidos a partir das respectivas gaiolas emergentes e distribuídos em proporções de idade semelhantes em vasos cilíndricos de plástico (400 mL) equipados com uma tampa apertada, que foi perfurada e o buraco coberto com uma fina gaze segurando um pedaço de algodão embebido em solução saturada de glucose. O número de moscas de areia em cada vaso era suficiente para um cão, com a adição de alguns exemplares extras para compensar as mortes ocorridas antes das experiências. As panelas foram colocadas em sacos plásticos herméticos fornecidos com papel filtro umedecido. A embalagem secundária consistia de um recipiente pré-aquecido fornecido com um dispositivo de estabilidade prolongada de temperatura e um gravador digital de temperatura, rodeado por uma caixa de papelão resistente. As caixas foram enviadas para Marrocos por via aérea e a entrega foi feita em aproximadamente 3 dias após o envio. Após a entrega, o registo de temperatura foi verificado e os sacos de plástico foram deixados por abrir a 25 ± 3 °C enquanto se aguardava a exposição dos cães. Uma avaliação grosseira da mortalidade da mosca da areia em potes foi feita do exterior, e uma taxa de mortalidade de ≤ 10% por pote foi considerada aceitável para uso. Finalmente, no momento das experiências, cada cão foi exposto à mesma população homogênea de moscas da areia envelhecendo de 7 a 14 dias.

Vinte e sete dias antes do tratamento, 14 cães Beagle machos foram sedados com Domitor® (Vetoquinol, Lure, França) e sua cabeça foi exposta por 1 h a mordidas de aproximadamente 40 fêmeas P. perniciosus enjauladas, juntamente com cinco machos para promover o comportamento de mordida, visando avaliar a atratividade individual ao vetor nestas condições experimentais. Os cães foram classificados em ordem decrescente com base na contagem de exemplares vivos alimentados com sangue; dois cães com as menores contagens foram excluídos do estudo, e doze cães foram incluídos e alocados em dois grupos de seis cães cada (Grupos 1 e 2). No dia 0, os cães do Grupo 2 foram tratados com uma dose oral de fluralaner (Bravecto® comprimidos mastigáveis) a uma taxa de dose de 25 a 56 mg/kg de peso corporal, enquanto que os cães do Grupo 1 permaneceram sem tratamento. Observações de saúde específicas foram realizadas às 1, 2 e 6 h após a administração de fluralaner ao último cão. A exposição dos cães a aproximadamente 40-60 P. perniciosus fêmeas (mais 5-10 machos) foi realizada em paralelo para ambos os grupos, em condições similares de temperatura e umidade em duas salas, nos dias 1, 28 e 84 (uma avaliação intermediária foi inicialmente considerada para o período em torno de 50-60 dias após o tratamento, embora isso não tenha sido possível devido a questões técnicas e logísticas). O critério primário para determinação da eficácia foi a taxa de sobrevivência das moscas da areia totalmente alimentadas com cães tratados versus aquelas totalmente alimentadas com cães de controle, com amostras parcial ou marginalmente alimentadas com sangue não sendo consideradas. Para permitir comparações óptimas e duradouras entre os dois grupos de exemplares de moscas da areia, as fêmeas foram recolhidas individualmente das gaiolas de exposição através de aspiração oral suave, e agrupadas em grupos de ≤ 10 exemplares dentro de vasos de plástico revestidos a gesso. Os vasos foram então colocados em caixas fornecidas com glicose saturada e papel filtro humidificado, e mantidos posteriormente a 26 °C. As avaliações de viabilidade foram realizadas às 6 horas (excepto no primeiro dia), e depois a intervalos de 24 horas até um máximo de 96 horas após o fim da exposição. Para avaliar a viabilidade geral do lote de areia utilizada em cada experiência, os procedimentos acima descritos foram aplicados tanto às fêmeas alimentadas como às não alimentadas.

A significância estatística dos resultados da eficácia inseticida, expressa como a proporção de mosca-da-arenga alimentada viva do Grupo 2 em relação à do Grupo 1, foi calculada utilizando um modelo linear misto, incluindo o grupo de estudo como efeito fixo e um bloco de aleatorização como efeito aleatório, com o nível de significância definido para α = 0,05 (bilateral). O modelo usou o ajuste Kenward-Rogers para determinar os graus de liberdade do denominador.

No dia 1, 78 amostras alimentadas com sangue de um total de 159 fêmeas vivas recolhidas de cães do Grupo 2 foram avaliadas versus 64 amostras alimentadas com sangue/169 fêmeas vivas de cães do Grupo 1. No dia 28, foram avaliadas amostras de sangue de 199/341 fêmeas vivas do Grupo 2, contra 146/310 do Grupo 1. No dia 84, foram avaliadas amostras de sangue de 240/326 do Grupo 2 e 206/339 do Grupo 1, respectivamente. A Tabela 1 mostra as proporções médias de P. perniciosus sobreviventes após a ingestão de uma refeição de sangue em cães tratados e não tratados. No dia 1 do tratamento, houve evidências de algumas mortes entre moscas da areia ingurgitadas já no momento da coleta das gaiolas de exposição do Grupo 2, embora nenhuma das do Grupo 1. Em 24 h, todas as amostras de sangue alimentadas com sangue do Grupo 2 estavam mortas, em contraste com 11% das amostras alimentadas com sangue do Grupo 1. No dia 28, a sobrevivência das amostras alimentadas com sangue de cães do Grupo 2 foi significativamente menor do que naqueles do Grupo 1 já às 6 h após a refeição de sangue; novamente, todas as amostras alimentadas com sangue do Grupo 2 estavam mortas às 24 h, em contraste com 3% das amostras alimentadas com sangue do Grupo 1. No dia 84, um número de exemplares alimentados com cães tratados sobreviveu até o final das observações, com amplas variações dentro do grupo; sua taxa de sobrevivência diminuiu a partir das 24 h e foi significativamente menor a partir das 48 h em comparação com os exemplares alimentados com cães de controle, com uma atividade inseticida calculada acima de 50% até 96 h de observação.

As taxas de sobrevivência das moscas de areia não tratadas recolhidas das gaiolas de exposição também foram avaliadas até 96 h após a exposição de cada cão. Elas foram geralmente elevadas e mais altas em comparação com as de exemplares alimentados com sangue, mostrando algumas diferenças entre cada dia de exposição de um cão, embora não tanto entre os grupos experimentais em cada exposição. Isto pode refletir variações de lote para lote na mortalidade que tipicamente ocorre entre gerações de moscas da areia colonizadas, e possivelmente diferentes condições de transporte. A ingestão de sangue foi a única variável associada com 100% de mortalidade de moscas da areia em cães tratados com fluralaner (Fig. 1).

O presente estudo, embora não comparando diferentes espécies de mosca da areia, fornece mais evidências de que a susceptibilidade a produtos inseticidas caninos visando o sistema nervoso central da mosca da areia, pode ser maior em P. perniciosus do que em P. papatasi. Usando a mesma formulação de fluralaner e doses em um estudo incluindo Beagles expostos a esta espécie, Gomez et al. (2018b) registraram sobrevivência parcial de fêmeas de P. papatasi alimentadas com sangue (na ordem de 6-7%) já aos 17-31 dias após o tratamento, que aumentou para aproximadamente 25% ao 45º dia.

Há > 5 dias de atraso para uma mosca da areia ser infecciosa após a ingestão de uma refeição de sangue infectada. Portanto, existe um desafio técnico para os estudos de inseticidas sistêmicos em moscas da areia no que diz respeito a manter uma alta e duradoura sobrevivência de espécimes de controle alimentados com sangue e detectar quaisquer efeitos inseticidas retardados que ainda tenham um potencial de bloqueio de transmissão. Este desafio é diferente da maioria dos estudos comuns com tratamentos anti-alimentação, onde as moscas da areia são mortas pelos operadores imediatamente após a exposição de um cão e pontuadas como sendo alimentadas/desalimentadas com sangue. Avaliações a longo prazo são necessárias para assegurar a interpretação significativa e significância estatística das diferenças de sobrevivência entre os grupos tratados e de controle (por exemplo, durante a fase descendente – concentrações de drogas no plasma canino). O uso de sangue canino ex vivo tanto de cães tratados como de controle em sistemas de alimentação artificial pode ser propenso à contaminação bacteriana e, portanto, resultar na morte rápida de qualquer mosca da areia ingurgitada, permitindo assim apenas uma estreita janela temporal para discriminar entre drogas activas e não activas (Gomez et al., 2018a). No presente estudo, a taxa de sobrevivência das amostras de controlo alimentadas com sangue foi muito satisfatória, com uma variação de 61-81% a 96 h após a refeição de sangue.

A farmacocinética do fluralaner no plasma canino após uma única administração oral mostrou uma tendência descendente regular até cerca de 100 dias após o tratamento, quando se torna indetectável (Kilp et al., 2014). É interessante notar que uma média teórica de aproximadamente 40-100 ng de fluralaner/mL de plasma, correspondente a 84 dias após o tratamento, ainda foi capaz de matar > 50% de P. perniciosus dentro de 48 h após uma refeição de sangue. Portanto, concentrações plasmáticas intermediárias, como as esperadas entre 28 e 84 dias após o tratamento, também são passíveis de proporcionar elevada atividade inseticida contra o vetor, e portanto novos estudos são necessários para confirmar isto. Por outro lado, os resultados do presente estudo em relação aos três pontos de tempo mostram claramente uma tendência coerente de redução da eficácia ao longo do estudo.

Em conclusão, o tratamento fluralaner de cães representa um método promissor para reduzir o pool de vetores infectados em cenários endêmicos de LV zoonótica. Além disso, o uso de fluralaner em combinação com tratamentos preventivos de piretróides tópicos, desde que isso não seja contra-indicado para a segurança de um cão (Walther et al., 2014), poderia proporcionar benefícios para cães em áreas de alto risco.