Nosso conhecimento sobre a origem e identidade celular das células de espuma in vivo é impressionantemente limitado, considerando a natureza onipresente dessas células em lesões ateroscleróticas e seu papel crítico na patogênese da lesão, incluindo conseqüências clínicas em estágio tardio, como infarto do miocárdio ou acidente vascular cerebral. Em estudos patológicos humanos de lesões avançadas,1 células de espuma, ou células ricas em lipídios, foram primeiramente identificadas como macrófagos usando anticorpos monoclonais para CD68, CD45 e HLA Classe II (cluster of differentiation 68, cluster of differentiation 45, e antígeno leucocitário humano classe II).2 Entretanto, estes foram rapidamente seguidos por estudos com anticorpos de actina melhorados que relatavam células musculares lisas (CMS) também poderiam dar origem a células de espuma, tanto em lesões humanas avançadas quanto em estágio inicial.3,4 No entanto, estudos recentes de rastreamento de linhagem realizados pelo nosso laboratório5-7 e outros8 mostraram que o uso apenas de genes marcadores para atribuir a origem celular não é uma abordagem confiável no contexto de uma lesão aterosclerótica. De fato, foi demonstrado que a SMC pode perder seus marcadores contráteis e expressar marcadores de macrófagos como CD68,5 células endoteliais e macrófagos podem sofrer transição mesenquimal e expressar marcadores de SMC,9-11 e algumas células em lesões humanas expressam tanto CD68 quanto ACTA2 (actina alfa 2), confundindo ainda mais nosso entendimento sobre a origem das células de espuma dentro das lesões.5,12

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Neste número de Arteriosclerose, Trombose e Biologia Vascular, Wang et al13 fornecem evidências intrigantes de que 60% a 70% das células de espuma nas lesões ateroscleróticas de camundongos são de origem aterosclerótica e não leucocitária. É importante ressaltar que as conclusões se baseiam no uso impressionante de métodos complementares, incluindo ratos rastreadores de linhagem de SMC, métodos citométricos de fluxo especializados que preservam células espumosas de origem leucocitária e não leucocitária e a demonstração de que células espumosas derivadas de SMC parecem ser negativas para o marcador pan leucocitário CD45. Esta última observação é importante porque este mesmo grupo demonstrou anteriormente que >50% das células espumosas em lesões coronárias avançadas humanas são ACTA2+ CD68+, mas CD45-, sugerindo que células não derivadas de leucócitos são também a principal fonte de células espumosas em lesões humanas, e não monócitos-macrófagos, como há muito se supõe.14,15 Embora os dados do rato pareçam convincentes, a interpretação dos dados humanos permanece controversa porque depende completamente da hipótese não comprovada de que todas as células de espuma derivadas de leucócitos em lesões humanas retêm a expressão do CD45. Uma limitação adicional é a incapacidade de fazer um rastreamento rigoroso da linhagem em estudos em humanos. Nosso laboratório desenvolveu anteriormente um método epigenético que permite a detecção de células derivadas de SMC baseado na detecção de H3K4diMe (dimetilação da lisina 4 na histona 3) da região promotora Myh11 (myosin heavy chain 11) em seções histológicas.6 Entretanto, este método terá utilidade limitada para a análise de células de espuma porque, como indicado por Wang et al, é praticamente impossível distinguir células de espuma individuais em lesões avançadas. Portanto, como estas limitações inerentes podem ser resolvidas?

Acreditamos que a solução será encontrada com base em análises de RNAseq de célula única (scRNAseq) de lesões humanas avançadas combinadas com estudos complementares de scRNAseq, citometria de fluxo e citometria de massa (CyTOF) de lesões avançadas de ratos da linhagem SMC traçando ateroscleróticos. Embora tenha havido recentemente uma série de estudos de RNAseq de lesões ateroscleróticas, até o momento acreditamos que estas têm tido grandes limitações no que diz respeito à resolução da controvérsia de décadas sobre a principal fonte celular de células de espuma. Esses dados destacam os conhecimentos únicos proporcionados por técnicas inovadoras, mas também exigem cautela na interpretação desses estudos e de outros e sugerem que uma maior exploração da identidade e propriedades celulares usando um rastreamento rigoroso da linhagem, juntamente com scRNAseq e ensaios avançados de nível de proteína, é uma área crucial para pesquisas futuras.

Wang et al usaram fixação lipídica seguida de coloração BODIPY (boro-dipirrometeno) e citometria de fluxo para tentar quantificar e caracterizar células de espuma em aortas ateroscleróticas de ratos de dieta ocidental alimentados ou envelhecidos com ApoE-/-. Uma técnica similar foi utilizada por Kim et al16 para isolar células de espuma BODIPY+ SSChi de aortas murinas ateroscleróticas para análise por RNAseq de célula única. Importante, ambos os estudos analisaram aortas inteiras e não lesões, de tal forma que a maioria das células analisadas não são derivadas de lesões ateroscleróticas per se, mas refletem populações gerais de células em lesões, meios e adventícias. Além disso, Kim et al se concentraram em células CD45+ classificadas para traçar o perfil das populações de macrófagos na aorta murina, o que naturalmente teria excluído as células de espuma derivadas de SMC descritas por Wang et al. O grupo incluiu dados scRNAseq sobre todas as células de espuma BODIPY+SSChi no suplemento. De interesse, estes dados mostram células positivas para ACTA2 e Sm22a que poderiam ser as células de espuma não derivadas de leucócitos descritas por Wang et al em seus estudos. Entretanto, é importante ressaltar que os resultados de scRNAseq podem não ser um método confiável para quantificar a origem das células espumosas porque Winkels et al encontraram evidências baseadas na deconvolução do RNAseq a granel que técnicas padrão de scRNAseq subamostra de macrófagos e monócitos por ≈65%.17 Esta pode ser a principal razão pela qual grupos particularmente interessados em populações de macrófagos precisariam concentrar estas células usando citometria de fluxo antes da análise, uma técnica seguida em vários trabalhos recentes descrevendo leucócitos dentro de vasos sanguíneos ateroscleróticos.16-18 No entanto, tais abordagens podem comprometer o poder potencial do scRNAseq para detectar a diversidade de tipos celulares e descobrir a importância de populações de células anteriormente desconhecidas na doença. De fato, nossos preconceitos não se aplicam apenas à entrada de células, mas também à interpretação dos dados do RNAseq, onde os investigadores obtêm uma transcrição completa das populações de células aórticas ou lesões e então procedem a nomear o tipo de célula com base no uso de alguns poucos marcadores familiares. Isto derrota o propósito de uma tecnologia destinada a separar grupos baseados em centenas ou milhares de genes e também pode levar a confusão para grupos que estudam populações similares de células.19,20 Esta última questão é particularmente problemática dada a agora bem estabelecida falta de confiabilidade do uso de alguns poucos genes de marcadores convencionais e familiares para identificar tipos de células dentro de lesões ateroscleróticas em estágio tardio.5,9-11 De fato, Wang et al reconhecem que 20% das células de espuma não-SMC também não expressam CD45, indicando que elas podem ser derivadas de outra fonte ou de macrófagos que não estão mais expressando CD45. Nenhuma técnica é completamente imparcial e, portanto, o uso de múltiplas técnicas complementares, incluindo traçado de linhagem, coloração imunohistoquímica, citometria de fluxo, CyTOF e sequenciamento, precisa ser o padrão ouro para futuros estudos investigando a identidade celular em aterosclerose.

Ambiguidade na identificação celular baseada no uso de um ou apenas alguns poucos genes marcadores também pode ter implicações terapêuticas críticas. Ou seja, uma terapia que pode ter efeitos benéficos em algumas células pode ter efeitos prejudiciais em outras células. Isto é claramente exemplificado em um recente artigo da Nature Medicine de nosso grupo21 que mostrou inesperadamente que o investimento e a retenção de SMC dentro da capa fibrosa de lesões ateroscleróticas avançadas dependem da sinalização do receptor IL-1b e IL-1. Em contraste, também está bem estabelecido que a IL-1b contribui para o desenvolvimento da aterosclerose.22 Da mesma forma, o ABCA1 (ATP-binding casette A1) foi mostrado por Wang et al para ser desregulado em células de espuma CD45-negativas, o que os autores propõem pode ser um mecanismo para seu acúmulo de lipídios ao longo do tempo. Talvez as diferenças sutis na capacidade de resposta dos tipos celulares ao microambiente da placa sejam críticas para a patogênese da lesão, uma vez que os tipos celulares no trabalho errado ficam presos. De fato, nós postulamos que células do tipo macrófago derivado de SMC são substitutos pobres para células fagocitárias profissionais e acabam sendo ingurgitadas com lipídios, mas têm uma capacidade limitada de se desfazer deles (Figura).

Em resumo, os estudos aqui relatados por Wang et al fornecem uma importante ligação entre observações de células espumosas em lesões humanas e modelos de camundongos e sugerem um papel subvalorizado da SMC na formação de células espumosas. As conclusões de Wang et al fornecem evidências convincentes de que muito mais pesquisa é necessária nesta área. Espera-se que através do uso combinado de modelos avançados de rastreamento de linhagem em camundongos e de perfis transcripcionais e proteômicos imparciais das células da lesão, possamos definir com mais precisão as origens e funções dos diversos tipos celulares presentes nas lesões e desenvolver novas abordagens terapêuticas poderosas para melhorar a estabilidade da placa e reduzir as complicações trombóticas tardias da aterosclerose.