RELATÓRIO DO CASO
Um menino de 5 anos foi diagnosticado com leucemia linfoblástica aguda em dezembro de 1994 e incluído no protocolo Fralle 93. A criança obteve remissão hematológica 6 semanas após o início da quimioterapia de indução. Ele foi visto como ambulatorial e respondeu bem ao tratamento nos anos seguintes. Contudo, numa consulta de Março de 1997, o paciente teve um episódio febril ao ser perfumado com o sistema Port-a-cath. O exame clínico não mostrou localização séptica. A contagem de leucócitos foi de 10.860/ml, com uma contagem absoluta de neutrófilos de 8.850/ml. Um conjunto de hemoculturas foi coletado do sistema Port-a-cath, e a cultura aeróbica em frasco produziu colônias pigmentadas de barras de coryneform gram-positivas. O rapaz recebeu ceftriaxona (1 g) por via intravenosa uma vez, seguida de cefadroxil 500 mg duas vezes por dia durante 7 dias. Devido à febre persistente, o cefadroxil foi administrado por mais uma semana e as drogas imunossupressoras foram descontinuadas durante o mesmo período. O histórico do paciente não foi notável durante os 2 meses seguintes, e nenhuma hemocultura foi realizada quando ele veio para suas visitas mensais. Em junho de 1997, a criança foi apresentada para consulta como subfebril e reclamando de cansaço. Um exame físico não revelou nenhum foco de infecção, e a contagem de leucócitos não foi elevada. Um conjunto de hemoculturas foi retirado do Port-a-cath, e a ampola aeróbica revelou as mesmas hastes de coryneform gram-positivas, posteriormente identificadas como Microbacterium sp. A bacteremia relacionada com o cateter foi diagnosticada, e o cateter venoso central foi retirado. A ampicilina (100 mg/kg/dia) foi administrada por via intravenosa perioperatória, sendo a primeira dose administrada 24 h antes da cirurgia. A condição clínica do paciente melhorou rapidamente em seguida. O Port-a-cath foi cultivado em ágar sangue Columbia. Dentro de 24 h a 37°C, uma cultura pura de colônias pigmentadas de amarelo de uma haste não-fermentativa, gram-positiva, um pouco descolorida tinha crescido. Infelizmente, subculturas foram perdidas e nenhum exame adicional pôde ser realizado.
A estirpe isolada das hemoculturas do paciente, rotulada CF36, era uma coryneform amarela pigmentada, com um metabolismo oxidativo, atividade proteolítica, e ácidos graxos celulares do tipo ramificado. Estas características gerais são sugestivas do gênero Microbacterium, que inclui tanto espécies fermentativas quanto oxidativas, esta última anteriormente chamada Aureobacterium (13).
A sequência do gene 16S rRNA (rDNA) foi estudada usando um conjunto de primers para amplificação. Os produtos PCR foram purificados a partir de gel de agarose com um kit de extracção QIAquick gel (Qiagen, Westburg, Países Baixos). A análise da sequência foi realizada com um sequenciador automático de ADN 3100 (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Foster City, Califórnia) usando o kit ABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequence Reaction Kit. Cada sequência foi comparada com os dados de sequência disponíveis em bases de dados usando o BLAST (10). Uma árvore filogenética foi construída pelo método de união vizinha (8, 11).
16S rDNA sequenciação baseada em 1.490 nucleotídeos da estirpe CF36 revelou os mais altos níveis de semelhança de 99,5% com a sequência de M. luteolum DSM 20143T e 99,3% com a sequência de M. oxydans DSM 20578T. Também foi estreitamente relacionado com as sequências de M. saperdae (99,2%) e M. liquefaciens (99,1%) (Tabela (Tabela 1).1). Quatro outras linhagens semelhantes foram coletadas de várias amostras de outros pacientes que foram rotuladas como CF7 isoladas de uma hemocultura, CF34 de um aspirado brônquico, CF130 de uma hemocultura, e CF40 de uma fonte humana desconhecida. Uma estirpe adicional, a CF128, foi obtida a partir de uma amostra vegetal. As cinco cepas apresentaram 16 sequências de rDNA semelhante à do tipo de M. oxydans, variando de 99,3 a 99,4% de semelhança, enquanto que as suas taxas de semelhança com a CF36 foram de 99,9 a 100%. Nove outros isolados clínicos apresentaram 99,9 a 100% de similaridade com a cepa do tipo M. oxydans.
TABLE 1,
16S rDNA seqüências similares entre M. oxydans.
TABLE 1,
16S rDNA seqüências similares entre M. paraoxydans CF36T e outras espécies de Microbacterium
| Microbacterium sp. | Acesso nº. | 16S rDNA similar ao CF36T (%) |
|---|---|---|
| Microbacterium arabinogalactanolyticum | Y17228 | 97.7 |
| Microbacterium arborescens | X77443 | 95.1 |
| Microbacterium barkeri | X77446 | 94.2 |
| Microbacterium gubbeenense | AF263563 | 93.2 |
| Microbacterium imperiale | X77442 | 95.0 |
| Microbacterium esteraromaticum | Y17231 | 98.0 |
| Microbacterium foliorum | AJ249780 | 98.5 |
| Microbacterium phyllosphaerae | AJ277840 | 98.3 |
| Microbacterium keratanolyticum | Y17233 | 98.0 |
| Microbacterium liquefaciens | X77444 | 99.1 |
| Microbacterium oxydans | Y17227 | 99.3 |
| Microbacterium saperdae | Y17236 | 99.2 |
| Microbacterium luteolum | Y17235 | 99.5 |
| Aureobacterium resistens | Y14699 | 98.3 |
| Microbacterium testaceum | X77445 | 98.6 |
| Microbacterium dextranolyticum | Y17230 | 97.2 |
| Microbacterium laevaniformans | Y17234 | 97.6 |
| Microbacterium maritypicum | AB004713 | 97.8 |
| Microbacterium flavescens | Y17232 | 97.2 |
| Microbacterium lacticum | X77441 | 97.5 |
| Microbacterium schleiferi | Y17237 | 97.7 |
| Microbacterium aurum | Y17229 | 96.9 |
| Microbacterium terregens | Y17239 | 95.7 |
| Microbacterium halophilum | AB004715 | 97.7 |
| Microbacterium thalassium | AB004713 | 97.9 |
| Microbacterium ketosireducens | AB004724 | 97.4 |
| Microbacterium terrae | Y17238 | 96.9 |
| Microbacterium kitamiense | AB013907 | 97.2 |
| Microbacterium aurantiacum | AB004726 | 97.0 |
| Microbacterium chocolatum | AB004725 | 96.7 |
| Microbacterium trichothecenolyticum | Y17240 | 97.1 |
| Microbacterium hominis | AB004727 | 97.0 |
Estes resultados nos levaram a realizar um estudo extensivo das seis cepas seguintes: CF36, CF7, CF34, CF40, CF128, e CF130.
Ácidos gordos celulares, determinados conforme descrito anteriormente (14), apresentaram o mesmo perfil em todas as estirpes. As porcentagens médias dos principais ácidos graxos celulares foram as seguintes: 40,3% anteiso-C15:0 (variação, 37,1 a 46,0%), 27% anteiso-C17:0 (variação, 22,9 a 31,3%), 15,7% iso-C16:0 (variação, 13,8 a 19,3%), 9,3% iso-C15:0 (variação, 4,6 a 13,9%), e 4,2% iso-C17:0 (variação, 3,0 a 7,2%).
Análise do peptidoglicano da parede celular CF36 e CF7 foi realizada no Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ; Braunschweig, Alemanha) por N. Weiss com um método de cromatografia em camada fina como descrito por Schleifer e Kandler (12). O peptidoglycan foi do tipo B2β com d-ornitina como o ácido diamino.
DNA-DNA foi realizado por P. Schumann no DSMZ como descrito por De Ley et al. (3) com as modificações de Escara e Hutton (4) e Huss et al. (7). A taxa de homologia de DNA CF36 com M. luteolum LMG 16207T foi de apenas 33,7%, e a do M. oxydans DSM 20578T foi de 46,6%, mas níveis elevados de relação de DNA de 78,1, 81,8 e 78,2% foram obtidos com as cepas CF7, CF34 e CF40, respectivamente. Isto foi consistente com a sua atribuição a uma única espécie. O teor de G+C do DNA da estirpe CF36 foi de 69,9 mol% conforme determinado na DSMZ.
As seis estirpes eram gram-positivas, motibles, hastes de coryneform. Elas cresceram bem no ágar sangue Columbia a 37°C, e a cor das colônias era amarela. As cepas eram estritamente aeróbias, catalase positivas, e oxidase negativas. Elas eram capazes de hidrolisar esculina e gelatina. Embora a sequência de 16S rDNA mostrou relações próximas com M. luteolum, M. saperdae e M. liquefaciens, estas espécies eram fenotípicas bastante diferentes. Nenhuma delas cresceu a 37°C, M. luteolum e M. liquefaciens eram não-móteis, e M. luteolum e M. saperdae eram não-proteolíticos. Estes achados estão de acordo com os dados da literatura (2). As propriedades fenotípicas das cepas foram mais semelhantes às do M. oxydans. A glicose foi oxidativamente acidificada em ágar vermelho de fenol de baixa peptona (15). Todas as cepas cresceram a 40°C, enquanto nenhum dos isolados de M. oxydans foi capaz de crescer a essa temperatura. Além disso, a salicina não foi acidificada, em contraste com os M. oxydans. As novas estirpes também podiam ser diferenciadas do M. oxydans pelas tiras de assimilação API 50CH (bioMérieux). A lactose foi utilizada, e o 2-ketogluconato não foi, enquanto o M. oxydans teve as reacções opostas. Quando as tiras API ZYM (bioMérieux) foram utilizadas, as reacções negativas para a esterase lipase (C8), α-chymotrypsin, e β-glucosidase separaram as seis estirpes de M. oxydans. As características fenotípicas que diferenciam as novas cepas de espécies de Microbacterium oxidantes, motistas e proteolíticas relacionadas que crescem a 37°C são relatadas na Tabela22.
TÁBULO 2.
Diferenciação de M. paraoxidantes de outros oxidantes, proteolíticos, espécies de Microbacterium motile que crescem a 37°Ca
| Teste | Resultado | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Microbacterium paraoxydans (n = 6) | Microbacterium oxydans (n = 10)b | Microbacterium barkeri DSM 20145T | Microbacterium foliorum LMG 19580T | Microbacterium phyllosphaerae LMG 19581T | Microbacterium maritypicum LMG 8374T | |||
| Crescimento a 40°C | + | – | + | + | – | – | – | |
| Ácido de salicina | – | + | + | + | + | >+ | ||
| Assimilação API 50CH | ||||||||
| 2-Ketogluconato | – | + | + | – | – | – | + | |
| d-Arabinose | + | + | – | – | – | – | – | |
| Lactose | + | – | + | – | – | – | – | |
| Rhamnose | + | + | – | – | (+) | – | – | |
| Raffinose | – | – | + | (+) | + | + | + | |
| N-Acetilglucosamina | + | + | + | – | – | – | – | |
| α-Methyl-d-glucosídeo | +/(+) | + | – | – | – | – | – | |
| API ZYM | ||||||||
| > Esterase lipase (C8) | – | + | > | +w | + | + | + | + |
| α-Chymotrypsin | – | + | – | – | – | – | – | |
| β-Glucosidase | – | + | + | + | + | + | + | |
A susceptibilidade a antibióticos foi testada em ágar Mueller-Hinton com tiras de teste E (PDM, Solna, Suécia). As faixas de MIC (microgramas por mililitro) foram as seguintes: penicilina, 1,5 a 2; ampicilina, 1 a 1,5; cefotaxima, 3 a 6; cefalotina, 16 a 24; ciprofloxacina, 1 a 1,5; gentamicina, 2 a 3; vancomicina, 3 a 4; claritromicina, <0,016.
Estudos fenotípicos, quimiotaxonómicos e genéticos sugerem que as seis estirpes de estudo pertencem ao género Microbacterium mas constituem uma nova espécie, para a qual o nome Microbacterium paraoxydans é proposto e que está intimamente relacionado com M. oxydans, M. saperdae, M. luteolum, e M. liquefaciens (Fig. (Fig.11).
Árvore não enraizada mostrando a posição filogenética do M. paraoxydans CF63T dentro do gênero Microbacterium. A barra representa uma substituição de nucleotídeos por 100 nucleotídeos.
Apenas poucos relatórios tratam do isolamento das espécies de Microbacterium do material clínico. A maioria foi inicialmente atribuída ao grupo CDC A-4 ou A-5, e isolados ainda mais recentes raramente foram identificados ao nível da espécie (1, 5, 6, 9). Em apenas um pequeno número de casos, o isolado provou ser o agente causador da infecção. Um caso de endoftalmite causado por uma Microbacterium foi relatado por Funke et al., e com base na sequência de 16S rDNA, pensou-se que a estirpe pertencia a uma espécie não descrita (6). Em um estudo de Microbacterium spp. encontrado em amostras clínicas, várias cepas foram identificadas como M. arborescens e M. imperiale, mas nenhuma confirmação genética foi realizada (5). Um surto nosocomial de bacteremia relacionada com Microbacterium foi relatado em pacientes com cancro, mas o organismo causador não foi identificado ao nível da espécie. Um cateter venoso central foi o principal fator de risco nesse estudo (1). Mais recentemente, foram relatados dois casos de bacteremia por Microbacterium relacionada a cateteres, identificados pelo sequenciamento de 16S rDNA. Um isolado foi 99,4% relacionado ao M. oxydans, e o outro 98,7% relacionado ao M. trichothecenolyticum, mas a identificação formal a nível da espécie não foi alcançada (9).
Tensão CF36 foi isolada de hemoculturas do paciente com intervalo de várias semanas, e embora o organismo isolado do cateter removido só pudesse ser identificado parcialmente, é provável que a bacteremia repetida estivesse relacionada ao cateter, confirmando que os cateteres intravasculares representam um fator de risco de infecção por esses organismos. Sua origem pode ser a pele do paciente, mas como o habitat natural das microbactérias é o ambiente inanimado, não se pode descartar a possibilidade de que fluido de perfusão contaminado tenha semeado o cateter do paciente.
Durante as últimas décadas, coletamos 30 isolados de microbactérias de origem humana em nosso laboratório. Todas estas cepas foram identificadas por um conjunto de características fenotípicas e quimiotaxonómicas e por 16S sequenciamento de rDNA. M. oxydans foi, de longe, a espécie mais frequentemente isolada, representando cerca de um terço das estirpes (9 em 30), seguida por M. paraoxydans (5 estirpes); M. aurum e M. lacticum foram cada uma representada por 4 estirpes. As oito cepas restantes estavam dispersas por várias espécies, com um M. foliorum isolado, um M. schleiferi isolado, um M. testaceum isolado, e cinco isolados que não se encaixavam em nenhuma espécie descrita.
Embora as microbactérias raramente estejam envolvidas em doenças humanas, o número de isolados relevantes encontrados em ambientes nosocomiais está aumentando. Embora mais de 30 espécies tenham sido reconhecidas no gênero, é provável que apenas um número limitado delas seja isolado de espécimes clínicos. Uma identificação mais precisa dos isolados humanos pode nos ajudar a entender melhor quais espécies são propensas a se tornarem patógenos oportunistas.
Descrição de Microbacterium paraoxydans sp. nov.
Células de Microbacterium paraoxydans (pa-ra-o′-xy-dans, porque o organismo se assemelha a M. oxydans) são pequenas, gram-positivas, hastes de coryneform que crescem aerobiamente a 20, 37, e 40°C. As colônias são amarelas brilhantes, lisas e às vezes pegajosas e atingem um diâmetro de 2 mm após 48 h de incubação a 37°C em ágar sangue. As estirpes são moídas por flagelos peritricos. Elas são catalase positivas, e oxidase negativas. Glicose, sacarose, maltose, galactose, frutose, manose e manitol são oxidadas, mas a salicina não é. A esculina é hidrolisada com algum atraso. DNase, gelatina e caseína hidrolisados são positivos. Não há decomposição da tirosina.
No sistema API 50CH, os seguintes compostos são assimilados: glicerol, d-arabinose, ribose, glucose, galactose, frutose, manose, ramnose, manitol, α-metil-d-glucosido, N-acetilglucosamina, esculina, salicina, celobiose, maltose, lactose, sacarose, trealose, melezitose, gentiobiose, d-turanose, l-fucose e gluconato. Sorbose, sorbitol, amígdalina, xilitol e d-fucose são assimilados por algumas cepas. Quando são usadas tiras de API ZYM, arilamidase leucina, fosfoamidase e α-glucosidase são positivas. Ácido e fosfatase alcalina, esterase (C4), β-galactosidase, N-acetilglucosaminidase, α-manosidase, e α-fucosidase são variáveis. Esterase lipase (C8), valine arylamidase, cistina arylamidase, tripsina, α-cymotrypsin, β-glucuronidase, e β-glucosidase são negativos. d-ornitina é o ácido diamino do peptidoglicano, e os principais ácidos graxos celulares são anteiso-C17:0, anteiso-C15:0, e iso-C16:0. As cepas são isoladas de vários locais do corpo. A estirpe do tipo é CF36T (= DSM 15019T = CCUG 46601T). Duas outras estirpes foram depositadas na DSMZ e na CCUG (Colecção de Cultura da Universidade de Gotemburgo, Gotemburgo, Suécia): CF7 (= DSM 15020 = CCUG 46602) e CF40 (= DSM 15021 = CCUG 46603). O conteúdo de G+C do ADN do tipo estirpe é de 69,9 mol%. Foi isolado do sangue humano.
Nucleotídeo número de sequência de adesão.
A sequência 16S rDNA da estirpe CF36 foi depositada na Biblioteca de Dados EMBL (Laboratório Europeu de Biologia Molecular) sob o número de acesso AJ491806.