Introdução

A presença de vértebras é uma característica que define o plano do corpo do vertebrado. Um esqueleto vertebral pode consistir de uma série de arcos neurais pareados que cobrem a medula espinhal, arcos hematológicos pareados que envolvem a artéria caudal e a veia e, em muitos vertebrados de mandíbula (gnathostomes), uma série de centra que substitui a notocorda como a estrutura de suporte predominante. Os centra vertebrais são altamente variáveis em termos de morfologia e composição dos tecidos, e provavelmente evoluíram independentemente em muitas linhagens diferentes de gnathostomas, incluindo tetrápodes, peixes teleostados e peixes cartilaginosos . Esta aparente convergência evolutiva levanta questões sobre a origem embrionária dos elementos esqueléticos vertebrais através dos gnathostomos.

Nos tetrápodes, todos os componentes do esqueleto vertebral derivam de somites: blocos transitórios, bilaterais de mesoderme paraxial segmentado que formam dorsais dentro do tronco embrionário. Os somitos são divididos em subdivisões dorsais e ventrais que dão origem ao tecido conjuntivo do tronco e à musculatura (‘dermomyotome’) e tecidos esqueléticos (‘sclerotome’), respectivamente. Experiências de rastreamento de linhagem celular usando quimeras de chick-quail e injeções de fluoresceína-dextran ou enxertos de embriões de GFP-transgênicos em axolotomo mostraram uma origem totalmente somítica do esqueleto vertebral nestes taxa, com células derivadas de somite recuperadas em arcos em desenvolvimento e cartilagem nascente do centra.

Conversamente, nos peixes com barbatanas de raios teleoeste, o esqueleto vertebral parece ter uma origem embrionária dupla, com contribuições tanto da mesoderme paraxial como da notocorda. A centrra vertebral teleost consiste numa camada interna (o acordeão) e uma camada externa, ambas compostas de osso que se forma por ossificação intramembranosa. O acordecentro dos teleósteos forma-se primeiro, por secreção de proteínas da matriz óssea (por exemplo, SPARC, colágeno tipo I) a partir de células ‘chordoblast’ que residem dentro do epitélio do notocorda. No zebrafish, os ensaios in vitro demonstraram que as células cultivadas de notocorda têm a capacidade de secretar a matriz óssea, e as experiências de ablação demonstraram que, na ausência de notocorda, a chordacentra não se forma . Os cordacentros de teleóstato são posteriormente rodeados por uma camada relativamente tardia de osso de membrana paraxial derivada da mesoderme. Além disso, os mutantes zebrafish com defeitos de padrões de somite possuem normalmente acordeamentos em desenvolvimento, mas apresentam profundos defeitos neurais e do arco hematológico, indicando a provável origem paraxial mesodérmica dos tecidos do arco.

Para determinar se a origem dupla da centrra vertebral é uma característica teleespecífica do esqueleto vertebral, ou uma característica geral para os gnathostomos que foi perdida nos tetrápodes, são necessários dados sobre a origem embrionária das vértebras de um grupo para os peixes ósseos (ou seja, Osteichthyes: o grupo que inclui os tetrápodes e os teleósteos). Os peixes cartilagíneos (Condrichthyes: tubarões, raias e holocefalanos) ocupam uma posição filogenética chave como o grupo irmão dos peixes ósseos, e os dados desta linhagem podem portanto ser usados para ajudar a inferir condições de desenvolvimento primitivas para o último antepassado comum dos gnathostomes. Mostramos anteriormente que as vértebras da pequena skate (Leucoraja erinacea) consistem cada uma numa espinha dorsal neural, dois conjuntos de cartilagens dorsais que envolvem a medula espinal (arcos neural e intercalares), um único arco hematológico e coluna vertebral que se estende ventralmente, e um centrum com três camadas (figura 1) . Aqui, usamos experimentos de mapeamento do destino de somite e notocorda, bem como hibridação in situ do mRNAm para genes que codificam proteínas de matriz esquelética, para testar a origem embrionária do esqueleto vertebral do skate. Mostramos que todos os componentes do esqueleto vertebral do skate derivam da mesoderme paraxial, sem evidências de contribuições celulares ou matriciais do notocorda. Quando considerados juntamente com dados de peixes ósseos, nossos achados apontam para uma origem mesodérmica paraxial geral e provavelmente primitiva da coluna vertebral em vertebrados de mandíbula.

Material e métodos

(a) Mapeamento do destino somítico

Briões de Leucoraja erinacea foram obtidos do Laboratório de Biologia Marinha (MBL) em Woods Hole, MA, e mantidos em uma mesa de fluxo marítimo a aproximadamente 16°C até S24. Uma aba foi cortada na caixa do ovo usando uma lâmina de barbear, e o embrião e a gema foram transferidos para uma placa de Petri. Os embriões foram anestesiados em uma solução de MS-222 (100 mg l-1 de metanossulfonato de 3-aminobenzoato de etilo – Sigma-Aldrich) em água do mar. CellTracker CM-DiI (Thermofisher) (5 µg µl-1 em etanol) foi diluído 1 : 10 em sacarose 0.3 M e injectado nas porções ventrais dos somitos (uma a três injecções por embrião) usando uma agulha capilar de vidro puxada e um injector de pressão Picospritzer (figura 2a). Os embriões foram então substituídos nas suas caixas de ovos e devolvidos à mesa do mar para se desenvolverem durante aproximadamente 7 ou 12 semanas. Os embriões foram então fixados com 4% de PFA, como descrito em Criswell et al. .

(b) Notochord fate mapping

Embryos foram mantidos como descrito acima até a S14, momento em que uma pequena janela foi cortada na caixa do ovo sobre o embrião. CM-DiI foi microinjetado no triângulo notocorda, como descrito acima (figura 2b). A janela foi então selada com casca de ovo doador e Krazy Glue™ gel (figura 2c), e os ovos foram devolvidos à mesa do mar para se desenvolverem por mais 16-18 semanas antes da fixação (como descrito em Criswell et al. ).

(c) Validação da colocação da injeção de CM-DiI

Para verificar a correta colocação das injeções de CM-DiI, três embriões com injeção de somite foram fixados imediatamente após a injeção, e três embriões com injeção de notocorda foram fixados 5 dias após a injeção (dpi). Os embriões foram fixados em paraformaldeído 4% em PBS durante a noite a 4°C, enxaguados 3 × 15 min em PBS e corados com DAPI a 1 µg ml-1 durante a noite à temperatura ambiente. Embriões injetados em alguma coisa foram imersos em microscópio Zeiss e embriões injetados em notochord-injected foram imersos em microscópios confocais Zeiss ou LSM 780.

(d) Histologia e hibridação in situ do mRNA

Embriões L. erinacea marcados com CM-DiI foram embutidos em cera de parafina e seccionados com 8 µm de espessura, como descrito em O’Neill et al. para análise histológica. Antes da incorporação, os embriões foram desmineralizados em 10% EDTA (ácido etilenodiaminotetracético) por 14 dias. A coloração histoquímica foi realizada seguindo o protocolo tricromado de Masson de Witten e Hall . Experimentos de hibridação in situ para Col1a1 (número de acesso GenBank MG017616) e SPARC (número de acesso GenBank MG017615) foram realizados em seções como descritas em O’Neill et al. , com modificações de acordo com Gillis et al. .

Resultados

(a) Contribuição somítica a todos os componentes do esqueleto vertebral do skate

Para testar a contribuição somítica ao esqueleto vertebral do skate, microinjetamos CM-DiI em porções ventrais dos somitos (ou seja, o presuntivo esclerotome-figura 3a) dos embriões do skate no estágio (S) 24 (Ballard et al. ). A rotulagem focal dos somitos (sem contaminação notocordeal) foi confirmada por microscopia da folha de luz, em embriões fixados imediatamente após a injecção (figura 3b; n = 3). Por 50-52 dpi (S31), células em forma de fuso do tecido areolar em desenvolvimento do centro rodeiam a notocorda, e o mesênquima pré-esquelético se condensou ao redor do tubo neural e da artéria caudal e veia. Em todos os embriões analisados nesta fase (n = 5), o CM-DiI foi recuperado nas células fusiformes do tecido areolar em desenvolvimento (figura 3c), indicando sua origem somítica.

Por 109 dpi (S34), as vértebras estão completamente desenvolvidas, com arcos neural, intercalares e hemorrágicos, e um centrum de três camadas (figura 1). Em embriões analisados nesta fase (n = 4), células CM-DiI-positivas foram recuperadas em todo o esqueleto vertebral. As células CM-DiI-positivas foram recuperadas na cartilagem neural (n = 3 vértebras em três embriões) e nos arcos hematológicos (n = 6 vértebras em quatro embriões; figura 3d,e), bem como na camada interna da cartilagem (figura 3f; n = 2 vértebras em dois embriões), no tecido areolar médio (figura 3g; n = 3 vértebras em três embriões) e na cartilagem externa do centro (figura 3h; n = 3 vértebras em três embriões). Em conjunto, estes achados demonstram uma contribuição somítica para todos os componentes principais do esqueleto vertebral do skate.

(b) Não há evidências de contribuição notocorda para o esqueleto vertebral do skate

Para testar a contribuição celular do notocorda para o esqueleto vertebral do skate, realizamos uma série de experimentos de mapeamento do destino do notocorda. Em peixes cartilaginosos, a notocorda deriva de uma pequena região triangular de células progenitoras (o ‘triângulo notocorda’) que aparece na margem posterior do blastodisco em S12 . Marcamos o triângulo notocorda de embriões de skate com CM-DiI em S14 (figura 4a), e confirmamos a localização do corante para o notocorda a 5 dpi (aprox. S17) usando microscopia confocal. Em três embriões examinados em S17, o CM-DiI foi encontrado apenas no notocorda (n = 2), ou no notocorda e tecido neural (n = 1) (figura 4b). Em nenhum caso foram detectadas células marcadas com CM-DiI na mesoderme paraxial.

Por isso rotulamos os triângulos de notocorda de vários embriões de skate em S14, e criamos estes embriões para 116-129 dpi (S34-no qual aponta o esqueleto vertebral tem completamente diferenciado). O CM-DiI foi recuperado dentro da notocorda (figura 4c,c′) e do epitélio da notocorda (figura 4d,d′) das regiões intervertebrais da coluna axial (n = 5). Em três embriões, células CM-DiI-positivas foram recuperadas nos remanescentes do epitélio da notocórdia que persistem no centro do centro, onde a notocórdia é quase completamente substituída pela cartilagem central da camada interna, mas nenhum condrócito CM-DiI-positivo foi recuperado na camada interna da própria cartilagem. Não foram observados condrócitos marcados com CM-DiI em nenhum outro componente da coluna axial. Estes experimentos, portanto, não fornecem evidências de uma contribuição celular da notocorda para o esqueleto vertebral.

Em teleósteos, as células de cordoblastos dentro dos componentes da matriz de secreção do epitélio da notocorda que compõem o osso acelular do cordacentro. Embora os patins não possuam um cordacentrum, o tecido areolar do centro do skate mineraliza e, na sua origem, fica adjacente ao epitélio do notocorda. Para testar se as células epiteliais do notocorda contribuem com componentes da matriz para o tecido central do skate, caracterizamos a expressão dos genes que codificam as proteínas da matriz óssea Col1a1 e SPARC no desenvolvimento da centrra do skate. Não detectamos a transcrição de Col1a1 (figura 5a) ou SPARC (figura 5b) no epitélio notocorda. Ao invés disso, essas transcrições localizaram-se nas células em forma de fuso do tecido areolar (figura 5a,b). Estes achados sugerem que as células paraxiais derivadas da mesoderme do tecido areolar – e não o epitélio notocorda – são a fonte da matriz extracelular do tecido mineralizado do centro vertebral do skate.

Discussão

As nossas experiências de mapeamento do destino somítico demonstram que o esclerótomo presuntivo contribui para todos os componentes das vértebras em skate, incluindo os arcos neural e hematológico, e todos os tecidos do centro vertebral em camadas triplas. Embora seja possível que DiI possa se difundir através da matriz extracelular após a injeção para contaminar tecidos adjacentes ao alvo pretendido (por exemplo, notocorda), nós controlamos essa possibilidade através da imagem de um subconjunto de embriões logo após a injeção para validar a precisão da nossa rotulagem, e através da realização de experimentos complementares de mapeamento do destino da notocorda. Neste último, descobrimos que a rotulagem CM-DiI das células progenitoras da notocorda resultou exclusivamente na rotulagem da notocorda e do epitélio da notocorda, sem qualquer contribuição para os tecidos vertebrais. Nos peixes teleost, as células de cordoblastos dentro do epitélio do notocorda expressam genes que codificam as proteínas da matriz óssea tipo I colagénio e SPARC , e são provavelmente a fonte da matriz óssea para a camada mais antiga do centro vertebral. Como os patins também possuem uma camada mineralizada dentro do seu centro vertebral, procuramos testar a expressão de Col1a1 e SPARC durante o desenvolvimento vertebral do skate através da hibridação in situ do mRNA. Encontramos estes genes a serem expressos exclusivamente dentro das células somiticamente derivadas em forma de fuso do tecido areolar (o precursor da camada média mineralizada do centrum-Criswell et al. ), e não no epitélio notocorda. Estes achados sugerem que as células e componentes matriciais do centrum vertebral do skate são inteiramente de origem paraxial mesodérmica.

Quando considerados juntamente com dados de peixes ósseos, nossa demonstração de uma origem somítica do esqueleto vertebral dos patins sugere que este tecido era provavelmente a sola, fonte primitiva de tecidos vertebrais esqueléticos em gnathostomes, com uma contribuição de notocorda para o osso do centrum representando uma condição derivada de peixes teleost (figura 6). Evidências de peixes com mandíbulas fósseis e sem mandíbula sugerem fortemente que o esqueleto vertebral do último ancestral comum dos gnathostomes consistia simplesmente numa série de arcos neurais e uma notocorda persistente, sem centra . Várias linhagens de gnathostomos, incluindo peixes cartilagíneos elasmobrânquios, teleósteos e tetrápodes, evoluíram subsequentemente centra independentemente uns dos outros . Na sua origem, o centrra vertebral dos elasmobrânquios e tetrápodes derivados inteiramente da mesoderme paraxial, mas uma camada interna de osso acelular derivado do notocorda foi incorporada ao centrum com a origem independente do centrra do teleósteo.

Ainda não está claro, no entanto, se esta condição especializada de teleosts é única entre os peixes de barbatanas de arraia. Apesar das recentes mudanças nos padrões filogenéticos, é muito provável que a centrra vertebral tenha evoluído independentemente em múltiplas linhagens de peixes sem raias (por exemplo, em gars e bichirs). Mas, não é claro se a notocorda contribui com tecido para as diferentes formas de centra observadas nestes taxa. Análises abrangentes das origens embrionárias dos tecidos vertebrais em taxa de peixes estrategicamente selecionados são necessárias para melhor resolver a montagem evolutiva e de desenvolvimento da diversa matriz de esqueletos axiais, sem dúvida a característica chave, dos vertebrados em geral.

Ethics

Todo o trabalho experimental foi feito em conformidade com os protocolos aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso Animal do MBL.

A acessibilidade aos dados

Os dados de sequência associados aos genes neste estudo estão disponíveis no GenBank (Col1a1 número de acesso MG017616 e número de acesso SPARC MG017615).

A contribuição dos autores

K.E.C. Concebeu o estudo, realizou histologia, mapeamento do destino e experimentos de hibridação in situ e redigiu o manuscrito; M.I.C. coordenou o estudo e forneceu informações sobre o manuscrito; J.A.G. desenhou partes do estudo, coordenou o estudo e ajudou a redigir o manuscrito. Todos os autores deram aprovação final para publicação.

Interesses concorrentes

Os autores declaram não haver interesses concorrentes.

Financiamento

Este estudo foi apoiado por uma Fundação Nacional de Ciência DDIG (DEB 1501749), um Prêmio de Pesquisa para Estudantes de Graduação em Laboratório Biológico da Universidade de Chicago/Marine, uma Companhia de Biólogos Bolsas de Viagem e uma Royal Society-Shooter International Fellowship (NF160762) para K.E.C.Uma Bolsa de Pesquisa da Royal Society University Research Fellowship (UF130182), uma Bolsa Isaac Newton Trust (14.23z) e uma Fundação de Ameixa de Laboratório Biológico Marinho John E. Dowling e Laura e Arthur Colwin Research Fellowships para J.A.G.e uma bolsa da National Science Foundation (DEB 1541491) e fundos de pesquisa da Universidade de Chicago para M.I.C.

Footnotes