Sinónimos

Ácidos gordos não esterificados (NEFA), ácidos gordos livres, ácidos gordos insaturados

Fisiologia

Ácidos gordos não esterificados (“livres” ou insaturados) (NEFAs) são o principal componente dos triglicéridos (as reservas de gordura no corpo), que consistem em três ácidos gordos ligados a uma espinha dorsal de glicerol. Em animais saudáveis (quando estão a comer ou não em estados com falta de energia), os NEFAs provêm principalmente da quebra dos triglicéridos ingeridos na dieta através dos quilómeros (a lipoproteína lipase liberta NEFA dos restos de quilómeros). Contudo, em condições de jejum ou estados de balanço energético negativo, a principal fonte de NEFA é a hidrólise de reservas de gordura no organismo.

Hidrólise de triglicéridos armazenados (gordura) no tecido adiposo pela lipase sensível aos hormônios libera NEFAs e glicerol. A lipase sensível ao hormônio (que é encontrada dentro do citosol dos adipócitos) é estimulada por várias hormonas, incluindo o glucagon (que é liberado a partir de α-células em ilhotas pancreáticas em resposta à baixa glicose) e corticosteróides. Uma vez liberado de gordura ou quilomirons, NEFAs pode ser usado como uma fonte de energia por muitos tecidos, incluindo músculo esquelético e hepatócitos. Nos hepatócitos, o seu destino difere dependendo das necessidades energéticas, do equilíbrio hormonal e da disponibilidade do substrato, ou seja, podem ser utilizados para a produção de energia (através do ciclo de Kreb), reembalados em triglicéridos e exportados como lipoproteínas de densidade muito baixa (VLDL) ou armazenados no fígado como triglicéridos (que em excesso podem causar lipidose hepática) ou convertidos em cetonas.

Metodologia

O método primário para medir a concentração de NEFAs no soro é um método enzimático colorimétrico, que é o método usado na Universidade de Cornell.

Tipo de reação

Reação de ponto final em branco. Blanking diminui o efeito da hemólise nas concentrações de NEFA.

Procedimento usado na Universidade de Cornell

Na primeira etapa desta reação em três estágios, a acilgl-CoA sintetase (ACS) catalisa a acilglatura de NEFAs para (coenzima A) CoA resultando na formação de acilgl-CoA. O peróxido de hidrogênio é então gerado a partir da oxidação da acilo-CoA através da ação catalítica da acilo-CoA oxidase (ACOD). Finalmente, o peróxido de hidrogênio na presença de peroxidase (POD) permite a condensação oxidativa de 4-aminoantipirina com 3-metil-N-ethyl-N-(β-hydroxyethyl)-aniline (MEHA) para formar um produto final azul-púrpura com uma absorvância máxima a 550 nm. A concentração de NEFA é directamente proporcional à densidade óptica medida do produto corante.

Reacções são mostradas abaixo:

NEFA+ ATP + CoA acyl-CoA synthesase > Acyl-CoA + AMP + pirofosfato

Acyl-CoA + O2 + acyl-CoA oxidase > 2,3-trans-Enoil-CoA + H2O2

2H2O2 + 4-aminoantipirina + MEHA peroxidase > complexo azul-púrpura+ 3H2O

Unidades de medida

A concentração de NEFAs é medida em mEq/L (unidades convencionais) ou mmol/L (unidades SI). A conversão de unidades é obtida da seguinte fórmula:

mEq/L x 1=mmol/L

Amostras consideradas

Tipo de amostra

Soro ou plasma EDTA. O soro/plasma deve ser separado das células logo após a coleta e o soro/plasma colocado em um tubo separado. Da mesma forma, os tubos corvac (soro separador) não são recomendados, porque os valores são ligeiramente (mas significativamente) mais elevados nestes tubos em comparação com os tubos não anticoagulantes (topo vermelho).

Anticoagulante

EDTA. Os valores são menos estáveis em heparina, que também produz concentrações de base mais altas do que EDTA ou soro e os valores de NEFA aumentam com o armazenamento (Stokol e Nydam 2005).

Estabilidade

Estável em soro bovino ou plasma EDTA a 4°C por 72 horas. Estável congelado em soro bovino por 1 mês (-70°C). Valores aumentados dentro de 24-48 horas de armazenamento a 24°C em soro ou plasma EDTA. As concentrações de NEFA aumentam rapidamente na heparina após o armazenamento. (Stokol e Nydam 2005).

Recomendações para coleta de amostras em vacas leiteiras de transição

• Anticoagulante: Tampa vermelha (soro) ou tampa roxa (EDTA). Evitar tubos de heparina (tampo verde) e corvac (separador de soro).
• Manuseamento: Separar das células o mais rápido possível, manter frio para minimizar falsas alterações nos resultados (NEFAs são particularmente instáveis), submeter o mais rápido possível ao laboratório.
• Hora da colheita: Amostra de vacas à medida que entram nas baias de alimentação (ver abaixo).
  • Preparar NEFAs: Recolher amostras de vacas 2-14 dias antes do parto.
  • Pós-parto NEFAs: Recolher amostras de vacas de 3-14 dias em leite. A medição de ambos NEFAs pós-parto e BHB é realizada em um perfil energético de transição da vaca para avaliação do status energético em vacas em lactação no Laboratório de Patologia Clínica da Universidade de Cornell.
• Número de vacas: Um mínimo de 12 animais por rebanho deve ser amostrado para teste de nível de rebanho (descrição do teste na seção de interpretação do teste abaixo). Isto pode ser uma mistura de novilhas e >2 vacas de paridade.
• Amostras combinadas: O agrupamento de amostras individuais de vacas para avaliar o status energético de um rebanho NÃO é recomendado. Estudos na Universidade Cornell mostraram que resultados de amostras combinadas são menos sensíveis que testes individuais de vacas (mínimo de 12 animais por rebanho) quando se utiliza o prepartum ou NEFA pós-parto para a detecção de balanço energético negativo excessivo em vacas leiteiras em transição.

Interferências

• Lipemia, icterus: Efeito desconhecido (raro no gado).
• Hemólise: Dependendo do método utilizado pelo laboratório, a hemólise irá diminuir ou aumentar os valores de NEFA. No método em branco utilizado na Universidade de Cornell, a hemólise grave (índice hemolítico > 800 unidades) irá diminuir suavemente as concentrações de NEFA no sangue bovino. Os interferentes lipêmicos e ictéricos não afetam substancialmente a concentração de NEFAs com os métodos usados pela Universidade de Cornell.
• Excite/exercício/estresse: Estas condições, que induzem a libertação de catecolamina ou ACTH, aumentam as concentrações de NEFA ao estimular a lipólise através da lipase sensível às hormonas. Estas condições devem ser minimizadas quando se recolhem amostras de sangue para medição da NEFA.
• Tempo da recolha de amostras: Os valores de NEFA são provavelmente mais elevados nas vacas que estão a chegar para a alimentação diária (provavelmente em algum grau de balanço energético negativo) versus as vacas que acabaram de ser alimentadas (a lipólise será inibida nestas últimas vacas). Recomenda-se a recolha imediatamente antes da alimentação.

Interpretação do teste

NEFA os testes são feitos principalmente em vacas leiteiras para determinar se o rebanho está em balanço energético negativo excessivo. É usado mais como um teste de nível de rebanho do que um teste individual de nível animal e os resultados são interpretados com respeito a uma concentração de corte ou porcentagem de animais com valores acima do corte versus valores acima do limite superior de referência. A medição NEFA pode ser feita em qualquer outra espécie como um marcador de balanço de energia negativa excessiva. Isto é mais freqüentemente feito em camelídeos (que desenvolvem lipidose hepática sob estas circunstâncias), outros ruminantes (por exemplo, caprinos, ovinos) para determinar se estão em risco de cetose, e cavalos (com síndrome metabólica equina). Observe que concentrações abaixo do limite de referência não são clinicamente relevantes.

Concentrações aumentadas

• Fisiológicos: O exercício induz a liberação de catecolaminas e ACTH, que estimula a atividade hidrolítica da lipase sensível a hormônios para promover a mobilização de gordura, a fim de atender ao excesso de energia necessária. Este processo aumenta a concentração de NEFAs no sangue.
• Diferenças da raça: Vários estudos têm mostrado que as NEFAs são mais baixas nas vacas de Jersey pós-parto do que nas vacas Holstein, portanto as diretrizes desenvolvidas para as vacas Holstein (ver abaixo) podem não ser aplicáveis a Jerseys (Rastani et al 2001, French 2006, Guretsky et al 2006, Brown et al 2012).
• Balanço energético negativo nas vacas leiteiras: As vacas leiteiras no período periparto (transição) estão sempre em um estado de balanço energético negativo devido à alta demanda de energia do feto em desenvolvimento e produção de leite (particularmente com ênfase na seleção para altos produtores de leite). No entanto, este estado de balanço energético negativo pode ser excessivo e as vacas afetadas estão em risco de doenças gastrointestinais (abomaso deslocado), metabólicas (cetose clínica) e infecciosas (por exemplo, metrite) no período pós-parto precoce. Assim, os profissionais do sector leiteiro frequentemente monitorizam os rebanhos leiteiros em busca de excesso de balanço energético negativo através de testes de NEFAs, quer isoladamente nas vacas pré ou pós-parto, quer como componente de um perfil metabólico nas vacas pós-parto. Os resultados destes testes podem ser interpretados a nível individual das vacas (ou seja, um valor NEFA acima de um determinado valor de corte indica excesso de balanço energético negativo) ou a nível do efectivo (ou seja, uma proporção das vacas testadas tem valores NEFA acima de um determinado valor de corte). A identificação de excesso de balanço negativo de energia em vacas individuais (e mais importante) no rebanho indica a necessidade de mudanças na nutrição (por exemplo, aumentar o espaço de alimentação do beliche, aumentar a densidade de energia da ração) e no manejo das vacas de transição para diminuir a demanda de energia e as tensões nas vacas de transição. As seguintes diretrizes de interpretação são baseadas em estudos feitos na Cornell University e são válidas para amostras coletadas de vacas Holstein “em risco” alimentadas com TMR entre 2-14 dias de pré-calvamento (prepartum NEFAs) ou 3-14 dias de pós-calvamento (NEFAs pós-parto). Recomendamos a amostragem de pelo menos 12 vacas ‘em risco’ ao avaliar a ração total mista (TMR) – alimentadas para cetose subclínica (Ospina et al. 2013).
  • Teste de nível de vacas
    • NEFAs pré-parto: Há um aumento da incidência de doenças pós-parto (abomaso deslocado, metrite/placenta retida e cetose clínica), diminuição da produção de leite e diminuição do desempenho reprodutivo nos primeiros 30 dias em vacas leiteiras Holstein (alimentadas com TMR) com valores NEFA > 0,30 mEq/L quando testadas 2-14 dias antes do parto.
    • Pós-parto NEFAs: Há um aumento da incidência de doenças pós-parto (abomaso deslocado, metrite/placenta retida e cetose clínica), diminuição da produção de leite e diminuição do desempenho reprodutivo nos primeiros 30 dias em vacas leiteiras Holstein (alimentadas com TMR) com valores NEFA > 0,60-0,70 mEq/L quando testadas 3-14 dias após o parto. Nos estudos de Cornell, NEFAs pós-parto foram na verdade um melhor preditor do que NEFAs pós-parto β-hydroxybutyrate concentrations or precalving NEFAs.
  • Herd level testing
    • Prepartum NEFAs: Ao nível do efectivo, existe um risco significativamente aumentado de doenças metabólicas e infecciosas pós-calvamento, diminuição da produção de leite ou diminuição do desempenho reprodutivo se >15% das vacas pré-calvamento testadas tiverem valores NEFA > 0,30 mEq/L. Note que, como indicado acima, não é recomendado o agrupamento de amostras de vacas individuais para testes de nível de manada.
    • Postpartum NEFAs: Ao nível do efectivo, há um risco significativamente maior de doenças metabólicas e infecciosas pós-calvamento, diminuição da produção de leite ou diminuição do desempenho reprodutivo se >15-20% das vacas testadas pós-calvamento tiverem valores NEFA > 0,70 mEq/L. Note que, como indicado acima, não é recomendado o agrupamento de amostras de vacas individuais para testes de nível de manada.
• Lipidose hepática em vacas leiteiras: Em um estudo, uma razão NEFA:colesterol >0,2 (unidades SI) tinha uma razão de probabilidade de 9,9 de um animal com lipidose hepática (definida como >10% de lipídio no fígado), sendo este corte mais sensível (63% com 85% de especificidade) do que BHB, NEFA sozinho ou atividade AST (>120 U/L) para o diagnóstico de lipidose hepática (com base na área sob a curva característica operacional receptora ou AUC). Entretanto, os animais deste estudo tiveram as medidas de sangue feitas em vários momentos após a lactação (Mostafavi et al. 2013).
• Balanço energético negativo em pequenos animais: Isto ocorre principalmente na diabetes mellitus. Em um estado de deficiência de insulina ou de inibição da resistência à insulina da lipase sensível a hormônios é perdida. Um desequilíbrio regulatório da atividade hormonal lipase aumenta a mobilização de gordura do tecido adiposo para o tecido hepático, elevando a concentração de NEFAs.
• Balanço energético negativo nos camelídeos: Os camelídeos doentes e stressados, particularmente as fêmeas grávidas, estão em risco de desenvolver lipidose hepática. A medição da NEFA pode ser feita para determinar se elas estão em balanço energético negativo. Camelídeos com NEFA > 0,8 mEq/L (Tornquist et al 2001) estão em risco aumentado de lipidose. Os camelídeos anoréxicos têm frequentemente NEFAs que estão aumentados mas abaixo deste valor e podem não desenvolver lipidose.