- Abstract
- 1. Introdução
- 2. mTOR Signaling Pathways and Pharmacological Inhibition
- 3. Consequências metabólicas da sobreativação da mTOR
- 4. Intolerância à Glicose Induzida por Inibidores mTOR
- 5. O Papel da Metformina na Reversão da Resistência à Insulina Induzida pelos Inibidores mTOR
- 6. Conclusão
- Conflitos de interesse
- Conhecimento
Abstract
mTOR (alvo mecanicista da rapamicina) a proteína cinase actua como integrador central de vias de sinalização de nutrientes. Além do papel imunossupressor após transplantes de órgãos sólidos ou no tratamento de alguns cânceres, outro papel promissor do inibidor de mTOR como terapêutico antienvelhecimento tem surgido nos últimos anos. O tratamento com rapamicina aguda ou intermitente tem alguma semelhança com a restrição calórica em efeitos metabólicos, como o aumento da sensibilidade insulínica. No entanto, a inibição crônica da mTOR pela macrólide rapamicina ou outros rapalogs tem sido associada à intolerância à glicose e resistência à insulina e pode até provocar diabetes tipo II. Estes efeitos metabólicos adversos limitam o uso de inibidores da mTOR. Metformina é um medicamento amplamente utilizado para o tratamento da diabetes tipo 2 que ativa a proteína quinase ativada por AMP (AMPK), atuando como mimético de restrição calórica. Além do efeito de diminuição do glucose-baixo resultante da diminuição da produção de glicose hepática e aumento da utilização de glicose, a metformina induz oxidações de ácidos graxos. Aqui, revisamos os recentes avanços em nosso entendimento das conseqüências metabólicas do metabolismo da glicose induzido pelos inibidores da mTOR e comparamos com o perfil metabólico provocado pelo uso da metformina. Sugerimos ainda o uso simultâneo de metformina com rapalogs a fim de abordar farmacologicamente o metabolismo da glicose comprometido e prevenir o desenvolvimento de diabetes mellitus new-onset após transplantes de órgãos sólidos induzidos pelo tratamento crônico com rapalogs.
1. Introdução
O alvo mamífero da rapamicina (mTOR) é uma serina citoplasmática/téreonina quinase da proteína quinase que pertence à família da fosfoinosite 3-quinase, relacionada à quinase PI3K, que opera como regulador central do metabolismo celular, crescimento, proliferação e sobrevivência. Ela é ativada por nutrientes (glicose, aminoácidos e lipídios), fatores de crescimento, insulina e citocinas inflamatórias. O mTOR tem uma posição única de sinalização intracelular, integrando todos esses fatores, e é um regulador crítico da resposta imunológica porque desempenha um papel central na detecção da disponibilidade de nutrientes, sinalização de citocinas/fator de crescimento, e fatores costimulatórios. Com exceção da inibição da proliferação de células T induzida pela interleucina-2, os inibidores de mTOR induzem o desenvolvimento de células Treg, suprimem a proliferação e maturação das células dendríticas e desempenham tantos papéis complexos nas conversas cruzadas entre células imunes, incluindo a promoção da produção de citocinas pró-inflamatórias em algumas circunstâncias.
O uso crescente de inibidores de mTOR nos últimos anos, como imunossupressores tanto no transplante de órgãos sólidos como no tratamento de certos tumores, como o carcinoma avançado de células renais, também nos confrontou com o desenvolvimento dos efeitos indesejados desta terapia. O desenvolvimento dos efeitos adversos é principalmente uma consequência da pleiotropia, um papel central da mTOR numa variedade de vias de sinalização que regulam o metabolismo, o crescimento e a senescência. Entre os efeitos indesejáveis mais comuns da terapia inibidora da mTOR está a síndrome metabólica que implica hiperglicemia com de novo diabetes mellitus (DM) e dislipidemia.
A análise retrospectiva dos dados do Sistema de Dados Renais dos EUA (pacientes de transplante renal) mostrou que o sirolimo estava independentemente associado a um aumento do risco de DM de novo início. Os pacientes tratados com everolimus podem desenvolver diabetes mellitus new-onset em até 32% dos casos, como resultado de hiperglicemia e resistência à insulina . A prevalência de hiperlipidemia é significativamente maior e ocorre em até 75% dos pacientes que são tratados com inibidores mTOR .
No entanto, os fatos já conhecidos de que o aumento da atividade mTOR está associado à resistência insulínica e que a restrição calórica e o tratamento de curto prazo com rapamicina levaram a um aumento na sensibilidade insulínica e na absorção de glicose sugerem um papel contraditório ou duplo dos inibidores mTOR e mTOR. Nesta revisão, vamos destacar e comparar os mecanismos da terapia com inibidores da mTOR com os mecanismos da ativação excessiva da mTOR levando a anormalidades metabólicas. Além disso, discutiremos potenciais estratégias terapêuticas para mitigar essas anormalidades.
2. mTOR Signaling Pathways and Pharmacological Inhibition
mTOR é composto de dois complexos multiproteicos distintos com diferentes funções celulares denominados mTORC1 e mTORC2 . O complexo mTORC1 contém cinco componentes: mTOR, que é a subunidade catalítica; proteína associada ao regulador do mTOR (Raptor); letal de mamífero com proteína Sec138 (mLST8); substrato Akt rico em prolina 40 kDa (PRAS40); e domínio DEP contendo proteína de interferência do mTOR (Deptor) . Raptor e mLST8 regulam positivamente a atividade e funções do mTOR, enquanto PRAS40 e Deptor são os reguladores negativos do mTORC1 .
O principal inibidor do mTORC1 é o complexo tuberoso de esclerose 1 (TSC1) e TSC2. Fatores de crescimento, nutrientes, citocinas, hormônios como insulina e nível de energia celular ativam várias vias como PI3K-Akt e RAS-mitogen-activated protein kinase (MAPK), levando à inibição do complexo TSC1-TSC2 . Como conseqüência, a mTORC1 não inibida, ou seja, ativada mTORC1, ainda mais através da S6 kinase 1 (S6K1), 4E-binding protein-1 (4EBP1), cinases dependentes de ciclina (CDKs), e o fator induzível pela hipoxia 1α (HIF1α), promove o metabolismo energético, a síntese protéica e a lipogênese, a proliferação e o crescimento . Na verdade, o mTORC1 ativado através de uma interação entre Raptor e um motivo de sinalização TOR (TOS) em S6K e 4EBP1 fosforilatos S6K1 e 4EBP1 . O fosforilatos S6K1 fosforilatos e depois os fosforilatos S6 (40S proteína ribossômica S6), melhorando assim a tradução dos mRNAs. O papel do 4EBP1 é o de inibir o início da tradução da proteína. Ele liga e inactiva o factor 4E (eIF4E) de iniciação da translação eucariótica. Quando o 4EBP1 é fosforilado pelo mTORC1, ele se dissocia do eIF4E, permitindo o aumento da tradução dos mRNAs e a transição de fase G1 para S. O mTORC1 também promove o crescimento regulando negativamente a autofagia, que é o processo central degradante nas células, mas está além do escopo deste artigo .
A sinalização PI3K/Akt e mTOR estão intimamente interligados. A ligação dos fatores de crescimento ao receptor do fator de crescimento tipo insulina (IGFR), receptor do fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGFR), ou receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) gera sinal a jusante, o que ativa a via PI3K/Akt. Quando a insulina se liga ao seu receptor de superfície celular, o recrutamento do substrato receptor de insulina 1 (IRS) é promovido com a ativação do PI3K e a produção do fosfatidilsitol (3,4,5)-trisfosfato (PIP3) (Figura 1). O PIP3 liga-se ao Akt e depois envolve esta cinase na membrana celular, para ser ativada por fosforilação pelo PDK1 . Fosforilatos Akt ativados vários substratos a jusante, incluindo o complexo TSC1/TSC2 , ativando assim o mTORC1 e os efetores a jusante do mTORC1 . A via a montante do IRS é regulada negativamente pela via do mTOR-S6K1 através de uma fosforilação directa em resíduos específicos . Essa maior degradação da IRS1, causada pela hiperfosforilação sobre resíduos serina/treonina, pode levar à resistência à insulina associada à sobreativação do mTOR.
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Em comparação com a mTORC1, sabe-se muito menos sobre os ativadores a montante da via mTORC2. mTORC2 responde aos fatores de crescimento como insulina, através de associações diretas ao ribossomo de forma PI3K-dependente . mTORC2 ativa diretamente o Akt através da fosforilação de seu motivo hidrofóbico (Ser473) e SGK1, uma cinase que controla o transporte e crescimento de íons . A perda do mTORC2 não impede a fosforilação de alguns alvos do Akt, como o TSC2, mas elimina completamente a atividade do SGK1 . Assim, PI3K/Akt, além da ativação do mTORC2, promovendo sua associação com ribossomos, também controla a ativação do mTORC1 através da inibição do TSC1/TSC2 dependente de Akt-dependente . Exceto pelo Akt e SGK1, PKC-α é outra cinase ativada pela mTORC2, que regula a forma celular afetando o citoesqueleto actínico .
Originalmente, pensou-se que o tratamento agudo com rapamicina, em contraste com a inibição da mTORC1, não perturba a sinalização da mTORC2, mas dados recentes confirmam que existe uma especificidade do tipo celular para a sensibilidade do conjunto mTORC2 à rapamicina. De qualquer forma, embora a mTORC2 seja menos responsiva à rapamicina e ao rapalogs, uma exposição prolongada a estes compostos leva a um conjunto mTORC2 suprimido, com a conseqüente inibição da sinalização Akt . Ao mesmo tempo, a terapia com rapalogs resulta em uma eficácia reduzida ou modificada, devido à existência de numerosos loops de feedback negativo no caminho do mTOR. A fosforilação direta do IRS1 pela via mTOR-S6K1, que promove a degradação do IRS1 e a desregulação do PI3K/Akt, já foi mencionada . É por isso que os rapalogs levam a uma diminuição do feedback negativo da via mTOR-S6K1 na via IRS, aumentando assim o fator de crescimento e a sinalização do Akt com um menor potencial apoptótico. Esta é uma das razões para a insuficiente atividade antitumoral dos inibidores mTOR.
No entanto, independentemente da associação de sobreativação mTOR e resistência à insulina, os rapalogs também podem causar resistência à insulina e hiperglicemia. Para explicar este fenômeno, é necessário olhar para os efeitos da inibição da mTOR em vários órgãos, em primeiro lugar incluindo o pâncreas e o fígado.
3. Consequências metabólicas da sobreativação da mTOR
O aumento pós-prandial da glicose e insulina ativa a mTOR e consequentemente a proteína quinase B (Akt) através da mTORC2. A ativação do Akt leva à absorção de glicose por uma translocação aumentada do GLUT4 para a membrana em adipócitos . A fosforilação e desativação do GSK-3 pelo Akt diminui a taxa de fosforilação da glicogênio sintetase e aumenta a atividade da glicogênio sintetase e o acúmulo de glicogênio, mais importante no fígado e nos músculos . Além disso, o Akt controla a homeostase da glicose por fosforilação e inibição do FOXO1, um fator de transcrição que regula a gluconeogênese . Além disso, o mTORC2 promove a síntese do glicogênio e diminui a gluconeogênese no fígado .
Como já mencionamos, é importante enfatizar que tanto os nutrientes quanto a insulina ativam o mTOR, mas o mTOR sobreativado causa ainda mais resistência à insulina por pelo menos dois mecanismos . O S6K1 ativado pelo mTORC1 causa a fosforilação e degradação do substrato receptor de insulina 1/2, prejudicando assim a sinalização da insulina. Ao afetar a proteína 10 ligada ao receptor do fator de crescimento, o mTORC1 também pode causar resistência à insulina. A eliminação de S6K1 é suficiente para melhorar a sensibilidade insulínica em ratos e roedores alimentados com gordura, enquanto o caminho do mTOR ativado leva a uma diminuição da sinalização de insulina e da resistência à insulina. Em humanos, a infusão de aminoácidos activa a via mTOR/S6K1 e, consequentemente, causa resistência à insulina nos músculos esqueléticos .
Assim, a sobreactivação da via mTOR no fígado, músculos, tecidos adiposos e pâncreas leva à resistência à insulina. Inicialmente, o mTORC1 estimula as funções das células β causando um aumento da secreção de insulina e a expansão e hipertrofia das células β. O eixo mTORC2-Akt afeta positivamente a massa celular de β, promovendo a proliferação e a sobrevivência. No decorrer da estimulação crônica do mTOR, o mTOR torna as células β resistentes ao IGF-1 e à insulina, promovendo a morte celular . Isso significa que a mTORC1 sobre-ativada no pâncreas β-células causa um aumento da secreção de insulina para compensar a resistência à insulina, mas, eventualmente, leva à falência de β-células.
A atividade da mTOR afeta também o metabolismo lipídico. A sinalização promove a lipogênese no fígado. Através da proteína de ligação de elementos reguladores de esterol (SREBP), a mTOR promove a lipogênese no fígado. A mTORC1 estimulada por insulina melhora a lipogênese e o armazenamento de lipídios, enquanto inibe a lipólise, a oxidação β e a cetogênese. O mTORC1 ativado tem impacto em três lipases: lipase adiposa triglicerídica (ATGL), lipase hormonal (HSL) e lipoproteína lipase (LPL). Nos adipócitos, a ATGL catalisa a lipólise de triactilglicerol para diacilglicerol, e então a HSL converte diacilglicerol para monoactilglicerol. mTORC1 reduz a atividade da HSL e diminui a atividade da LPL extracelular, que é importante para a absorção de lipoproteínas nos tecidos. A ativação do mTORC1 reduz a produção corporal de cetonas ao inibir a atividade PPAR-α no fígado .
Ao coordenar vários níveis da expressão gênica, o mTORC1 controla a massa mitocondrial e as funções. A perda da mTORC1 no músculo dos ratos reduz a função oxidativa e a massa muscular levando a uma morte precoce . A perda do tratamento com mTORC1 ou rapamicina reduz a expressão do coactivador receptor peroxisómico activado pelo proliferador 1-alfa (PGC-1α) e inibe o complexo de PGC-1α com o factor de transcrição yin-yang 1 YY1 . A rapamicina diminui a expressão gênica do PGC-1-alfa, dos receptores alfa relacionados ao estrogênio e dos fatores respiratórios nucleares, que são reguladores transcripcionais mitocondriais, resultando em uma diminuição da expressão gênica mitocondrial e do consumo de oxigênio. YY1 regula a expressão gênica mitocondrial e é um alvo comum de mTOR e PGC-1alfa. A inibição da mTOR resulta em uma falha na interação do YY1 e tem sido co ativado pelo PGC-1alfa, deprimindo assim a função oxidativa mitocondrial .
Ultimamente, a resistência à insulina devido à elevada atividade mTOR, caracterizada pelo aumento da gluconeogênese hepática, redução da absorção de glicose pelos músculos, e apoptose pancreática β-célula, leva à diabetes tipo II. Levando em consideração que a resistência à insulina e complicações associadas como retinopatia, neuropatia e nefropatia podem preceder o diagnóstico de diabetes tipo II levanta a questão da possibilidade de prevenção de complicações diabéticas usando inibição farmacológica da via mTOR.
4. Intolerância à Glicose Induzida por Inibidores mTOR
É óbvio que a mTOR tem múltiplos papéis no metabolismo e, quando ativada em excesso pela sobrecarga de nutrientes e obesidade, participa na causa da intolerância à glicose e resistência à insulina. A restrição calórica, que significa uma redução na ingestão calórica, mantendo uma nutrição adequada, melhora a tolerância à glicose e a sensibilidade insulínica e prolonga a vida útil. Dado o pressuposto de que a rapamicina é um mimético de fome, o seu papel tem sido sugerido na inversão da resistência insulínica. O tratamento agudo com a rapamicina (injeção única) aumenta a sensibilidade insulínica e a absorção da glicose. Em voluntários saudáveis, uma dose única de rapamicina como pré-tratamento abusa a resistência insulínica induzida por nutrientes . Em contraste com os resultados do tratamento agudo ou intermitente com rapamicina, o tratamento crônico com rapamicina prejudica a homeostase da glicose. Paradoxalmente, o tratamento crônico com a rapamicina leva à intolerância à glicose tanto em animais quanto em humanos . Embora o tratamento da rapamicina crônica reduza o conteúdo de gordura, também promove a resistência à insulina, a intolerância à glicose e a gluconeogênese no fígado. Apesar da melhor sinalização da insulina no fígado de ratos tratados com rapamicina, que saiu do bloqueio do laço de feedback negativo mTOR/S6K1, a indução da via gluconeogênica no fígado potencializa a intolerância à glicose . Embora o tecido adiposo branco e os músculos esqueléticos absorvam glicose normalmente em resposta à estimulação contínua da insulina durante o tratamento crônico da rapamicina, a resistência à insulina hepática é um grande contribuinte para a homeostase da glicose comprometida. Foi demonstrado que a supressão da gluconeogênese hepática mediada pela insulina é mediada diretamente pela ruptura mTORC2 induzida pela rapamicina. Com exceção da inibição da mTORC2, o tratamento crônico da rapamicina contribui para a resistência à insulina, devido à incapacidade de ativar o ácido graxo β-oxidação e cetogênese, levando a um desequilíbrio no metabolismo lipídico . Além disso, um tratamento prolongado com rapamicina leva a uma diminuição da viabilidade celular β e a uma diminuição da secreção de insulina, provavelmente através da inibição da mTORC2 . Este aumento da toxicidade das células β induzida pelo tratamento com inibidor crônico de mTOR pode ser uma ponte que leva ao desenvolvimento de novo aparecimento de diabetes mellitus após transplantes de órgãos sólidos, impondo a necessidade do desenvolvimento de estratégias para evitar este efeito adverso.
5. O Papel da Metformina na Reversão da Resistência à Insulina Induzida pelos Inibidores mTOR
A importância clínica da resistência à insulina está associada à doença arterial coronariana e ao acidente vascular cerebral isquêmico . A metformina, um medicamento amplamente prescrito contra a diabetes, é um biguanida e representa a primeira linha do tratamento para a diabetes mellitus tipo II . Não só diminui a hiperglicemia principalmente pela diminuição da gluconeogénese hepática, mas também aumenta a sensibilidade à insulina e diminui o nível de lipídios no sangue. No entanto, além do tratamento da diabetes mellitus tipo II, a metformina mostrou seu efeito benéfico em doenças relacionadas ao envelhecimento, tais como câncer e doenças cardiovasculares . Em todas estas condições relacionadas com o envelhecimento, a metformina tem conseguido efeitos semelhantes aos efeitos da terapia com rapamicina. Vários estudos epidemiológicos confirmaram que o tratamento da diabetes tipo II com metformina foi associado a uma redução da incidência de câncer e morte relacionada ao câncer . Diferentes modelos experimentais em animais também mostraram efeitos anticancerígenos variáveis e de prolongamento dependendo da dosagem, sexo e idade no início do tratamento com metformina .
Os mecanismos moleculares da metformina são apenas parcialmente compreendidos. Os múltiplos mecanismos de ação têm sido estudados, sugerindo inibição da cadeia respiratória mitocondrial (complexo I) como o modo primário de ação. . Como resultado, uma diminuição no status de energia celular com um aumento da AMP celular : a razão ATP ativa a proteína quinase ativada pela AMP (AMPK), que inibe a sinalização mTORC1 no fígado, o local primário de ação da metformina, com diferentes efeitos a jusante . Numa dosagem inferior, a metformina requer AMPK e o TSC para inibir a mTORC1, enquanto que numa dosagem superior, este efeito é independente da AMPK e do TSC . De qualquer forma, a metformina diminui a síntese de uma proteína hepática através de um mecanismo que implica um efeito inibidor sobre a mTORC1. Ao induzir a fosforilação do fator intensificador do GLUT4, a metformina aumenta a absorção periférica de glicose, aumentando assim a sensibilidade insulínica. Além disso, a metformina diminui a supressão da oxidação dos ácidos graxos induzida pela insulina. O efeito parece ser atribuível a uma estimulação do AMPK e à redução do conteúdo de malonil-CoA nos músculos.
Todos estes efeitos metabólicos são quase idênticos aos efeitos da fome, ou seja, da restrição alimentar. Foi demonstrado que os ratos tratados com metformina tinham um perfil transcripcional semelhante ao dos ratos sujeitos a restrição alimentar. Embora tanto a rapamicina quanto a restrição dietética inibam a lipogênese e ativem a lipólise com o conseqüente aumento dos níveis séricos de ácidos graxos nãoesterificados, ao contrário da restrição dietética, a rapamicina não ativa β-oxidação . Considerando que as duas principais características do distúrbio metabólico causado pela rapamicina são a estimulação da gluconeogênese no fígado e a diminuição da β-oxidação, a metformina é imposta como uma solução potencial. Como a diminuição da oxidação dos ácidos graxos está associada ao desenvolvimento da resistência à insulina, a oxidação dos ácidos graxos induzida pela metformina pode contribuir para o aumento da sensibilidade insulínica. A adição de metformina ao tratamento da rapamicina crônica pode fornecer uma abordagem terapêutica para tratar a resistência à insulina e a dislipidemia. A maioria da literatura discute o uso combinado de metformina e rapamicina com o propósito de tratar doenças relacionadas ao envelhecimento e ao envelhecimento. Outra opção sugerida para prevenção, ou seja, tratar distúrbios metabólicos causados pela rapamicina, é uma aplicação intermitente de rapamicina, levando em conta o fato de que após a interrupção da terapia de rapamicina, a resistência insulínica e a intolerância à glicose são reversíveis. É claro que esta abordagem não pode ser usada em pacientes tratados com terapia imunossupressora para prevenir a rejeição do transplante ou em pacientes que tomam inibidores de mTOR como tratamento anticancerígeno, onde a terapia com inibidores de mTOR deve ser contínua.
O estudo assim realizado resumiu os efeitos da rapamicina sobre a mTORC1 e mTORC2, apontando para o fato de que um tratamento a longo prazo com rapamicina além da mTORC1 também perturba a mTORC2, causando assim a toxicidade das células β e a resistência à insulina . Este efeito da inibição da mTORC2 foi confirmado in vivo em múltiplos tecidos, incluindo o fígado, tecido adiposo branco e músculo esquelético . Dada a suposição de que os efeitos imunossupressores da rapamicina são mediados predominantemente via mTORC1, pode-se supor que os inibidores específicos da mTORC1 alcançariam os mesmos efeitos imunossupressores que a rapamicina, mas sem qualquer toxicidade mediada pela mTORC2. Esta suposição pode estar operando quando os inibidores da mTORC1 são usados como terapêutica antienvelhecimento porque a inibição da mTORC1 alcançaria os efeitos desejados evitando distúrbios metabólicos causados pela inibição da mTORC2 .
Seria assim se os inibidores específicos da mTORC1 fossem usados como drogas imunossupressoras? Parece que efeitos imunossupressores importantes da terapia com inibidores do mTOR são mediados pela inibição tanto do mTORC1 como do mTORC2. Além da inibição da proliferação de células T e do bloqueio da maturação das células dendríticas, uma das marcas registradas das propriedades imunoregulatórias dos inibidores mTOR é o desenvolvimento de Tregs, cuja diferenciação e expansão são suprimidas pela atividade mTORC2. Isto significa que a inibição específica da mTORC1 nas células pertencentes ao sistema imunológico sem interrupção da mTORC2 pode levar a uma imunossupressão insuficiente.
Há algumas indicações de que outros rapalogs, como everolimus e temsirolimus, atingem um grau inferior de inibição da mTORC2 e, portanto, um grau inferior de resistência à insulina, mas isto ainda precisa ser confirmado em outros estudos .
Ainda, a necessidade do uso constante de inibidores da mTOR após transplantes de órgãos sólidos, como o transplante renal, impede o regime de aplicação intermitente de rapamicina ou o uso de rapamicina em doses menores. Na tentativa de resolver este problema, ou seja, para prevenir a resistência insulínica e o diabetes recém-estabelecido após um transplante renal, a terapia combinada de rapamicina e metformina tem sido sugerida. Ao induzir AMPK em doses clinicamente relevantes, a metformina inibe a mTORC1, ajudando a reduzir a dose de rapalogs e os efeitos metabólicos adversos associados. Se os pacientes com transplantes renais tiverem, a metformina pode ser prescrita para o tratamento da diabetes mellitus tipo 2 pré-existente ou da diabetes mellitus new-onset .
6. Conclusão
Tentamos mostrar que o uso da metformina também é possível para prevenir o aparecimento da diabetes mellitus após um transplante renal. Até agora, não foram realizados estudos para investigar o papel da metformina na prevenção do diabetes mellitus new-onset após um transplante. A pesquisa futura pode resultar em diretrizes clínicas, o que nos permitirá melhor combater os efeitos adversos mediados pelo rapalog.
Conflitos de interesse
Os autores declaram não ter conflitos de interesse.
Conhecimento
Este trabalho foi apoiado por subsídios do Ministério da Ciência e Tecnologia da República da Sérvia (nos. 175089 e 175097). Os autores também agradecem à Hemofarm AD pelo apoio adicional para que este trabalho seja publicado.