Morpholino Oligos são ferramentas avançadas para bloqueio de locais no RNA para obstruir processos celulares. Um Morpholino oligo se liga especificamente ao seu local alvo selecionado para bloquear o acesso de componentes celulares a esse local alvo. Esta propriedade pode ser explorada para bloquear tradução, emenda de blocos, bloquear miRNAs ou seus alvos, e bloquear atividade de ribozyme.
Translation Blocking: Ao bloquear estericamente o complexo de iniciação de tradução, Morpholinos pode derrubar a expressão de muitas sequências de alvo completamente o suficiente para que depois de esperar que a proteína existente se degrade, a banda de proteína alvo desapareça dos bloqueios ocidentais. Ao contrário de muitos tipos antisensos (por exemplo, siRNA, fosforotioatos), os Morpholinos geralmente não causam degradação de seus alvos de RNA; ao invés disso, eles bloqueiam a atividade biológica do RNA alvo até que o RNA seja degradado naturalmente, o que libera o Morpholino. Isto significa que RT-PCR não é adequado para o ensaio de bloqueio de tradução por Morpholinos.
Splice Blocking: Ao bloquear locais envolvidos na emenda de pré-mRNA, o Morpholinos pode ser usado para modificar e controlar eventos normais de emenda. Esta atividade pode ser convenientemente testada por RT-PCR, com a modificação bem sucedida da emenda aparecendo como alterações na banda do produto RT-PCR em um gel eletroforético. A banda pode mudar para uma nova massa ou, se a emenda-modificação desencadear uma decadência mediada pelo absurdo da transcrição, a banda de emenda selvagem perderá intensidade ou desaparecerá.
Como todos os reagentes de emenda de genes, os Morpholinos devem ser ativamente entregues na maioria das células. Os morfolinos podem ser entregues em células cultivadas através de uma variedade de métodos, incluindo o raspagem de células aderentes, electroporação e até mesmo microinjecção. No entanto, o nosso reagente de entrega Endo-Porter geralmente dá uma excelente entrega em células cultivadas em termos da quantidade de Morpholino entregue por célula, distribuição uniforme em toda uma população de células, reprodutibilidade de entrega e não toxicidade para a maioria dos tipos de células na concentração recomendada. Para experiências em animais, os nossos Vivo-Morpholinos, com a sua parte anexa ao parto, entram nas células do sangue após a administração de i.v. ou entram nas células dos tecidos que envolvem as injecções locais; são também os oligoelementos antisensos mais convenientes para uso em culturas celulares ou explantes, uma vez que não requerem qualquer agente adicional para o parto citosólico.

A Morpholino oligo é radicalmente diferente dos ácidos nucleicos naturais, com anéis de metilenemorfolina substituindo a ribose ou moieties de açúcar desoxirribose e ligações não iônicas de fosforodiamidato substituindo os fosfatos aniônicos de DNA e RNA. Cada anel de morfolina posiciona adequadamente uma das bases de DNA padrão (A,C,G,T) para emparelhamento, de modo que um Morpholino oligo de 25-bases se ligue forte e especificamente ao seu local alvo complementar de 25-bases em um filamento de RNA via emparelhamento Watson-Crick. Como a espinha dorsal não carregada do Morpholino oligo não é reconhecida pelas enzimas, ele é completamente estável às nucleases.
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1. Avaliando a entrega

Como com todos os agentes de derrubada de genes, a entrega eficaz de Morpholinos é crucial. Embora a confirmação do parto não seja crucial para experimentos usando microinjeção embrionária, confirmar o parto é importante para experimentos com células cultivadas. O nosso reagente de entrega Endo-Porter geralmente dá uma entrega simples e confiável para a maioria dos tipos de células. Você pode avaliar se você está recebendo um bom parto no citosol de suas células usando um Morpholino marcado com fluorescência. Recomendamos que utilize o nosso controlo standard de Morpholino com marcação fluorescente para este fim.
Quando utilizar um Morpholino fluorescente para confirmar a entrega, comece com uma concentração de 10 Morpholino oligo microMolar no meio de cultura. Esta é uma concentração suficientemente elevada para que após 16 horas o Morpholino com marcação fluorescente seja visível no citosol por microscopia de fluorescência. Um microscópio fluorescente invertido é a melhor escolha para a observação de células em placas de cultura. Observar as células vivas (não fixas). Use uma lente objetiva seca com a maior abertura numérica disponível para colher a maior quantidade possível de luz das células. O sucesso do parto é manifestado pela fluorescência difusa em todo o citosol. A fluorescência de punção geralmente indica que o oligo está preso em endossomos, portanto ignore as manchas de punção e procure a fluorescência difusa.
Para experimentos reais entregando seu Morpholino de sequência personalizada com Endo-Porter você geralmente precisa de uma concentração de apenas 1 a 5 microMolar para bloqueio estéreo efetivo da maioria dos mRNAs.
Solubilidade e MorpholinosEmbora os Morpholino oligos sejam muito mais solúveis que outros tipos estruturais não-iônicos (como PNAs), alguns Morpholinos com alto teor de G (>30%) têm solubilidade limitada. Além disso, a fixação do nosso fluor lissamínico emissor de vermelho às vezes diminui a solubilidade do oligoeleigo. A solubilidade varia de acordo com a sequência de oligo e é difícil de prever. As recomendações abaixo podem ajudar a manter a atividade do oligo se a sua seqüência tiver solubilidade deficiente.
Para armazenamento a longo prazo as soluções de estoque de Morpholino são melhor armazenadas liofilizadas, A próxima melhor escolha é o armazenamento em solução à temperatura ambiente. Fazer soluções de estoque de Morpholino com ou abaixo de 1 milliMolar ajuda a evitar problemas de solubilidade. Ciclos de congelamento/descongelamento ou armazenamento a longo prazo a 4C podem causar precipitação ou associação de Morpholino em recipientes e diminuir a actividade da solução; recomendamos o armazenamento a temperatura ambiente em recipientes bem fechados e, para evitar a evaporação em caso de selagem defeituosa do frasco, é prudente armazenar as reservas num ambiente húmido como um humidificador (por exemplo, um frasco de campânula com um copo de água aberto). Tenha cuidado para que o oligo não seque, pois pode ser difícil ou impossível dissolver novamente um oligo seco (embora os oligos liofilizados se dissolvam com bastante facilidade). Manter o frasco numa caixa escura ou embrulhado em papel alumínio é uma boa prática, uma vez que os oligo-elementos marcados com flúor podem fotobleach à luz.
A agregação em solução pode causar uma diminuição da actividade biológica ao longo do tempo e isto pode ocorrer em soluções armazenadas à temperatura ambiente. Isto pode ser revertido em alguns casos por aquecimento 5 min a 65C ou na maioria dos casos por autoclavagem (use o ciclo líquido). Os oligos são muito estáveis ao calor e podem tolerar várias rondas de autoclavagem sem degradação. Muitas vezes a autoclavagem reanimará um estoque que perdeu alguma atividade devido à agregação do oligo.
DNA, RNA, e a maioria dos reagentes de derrubada de genes são tipicamente armazenados em um banho de gelo durante experimentos para minimizar a degradação por nucleases. Como os Morpholinos são completamente resistentes à degradação enzimática e as soluções aquosas são quimicamente estáveis indefinidamente (anos) à temperatura ambiente, nós recomendamos que durante seus experimentos você mantenha suas reservas de soluções de Morpholinos à temperatura ambiente. O arrefecimento das suas soluções de reserva num banho de gelo simplesmente corre o risco de provocar a precipitação do Morpholino.
Estas precauções são mais do que necessárias para a maioria das sequências, mas o seu uso rotineiro ajuda a evitar surpresas desagradáveis no caso de encontrar uma sequência com baixa solubilidade.