Introdução

4-hidroxi-L-prolina (hidroxiprolina) é um aminoácido não-proteinogênico, que tem um peso molecular de 131,13g/mol e é sintetizado pela hidroxilação pós-tradução da prolina durante a biossíntese do colágeno (Fig. 1). Investigações do metabolismo fisiológico e patológico do colágeno são as medidas de hidroxiprolina mais utilizadas no plasma, urina e tecidos corporais. Portanto, a determinação da hidroxiprolina fornece informações úteis para o diagnóstico e prognóstico de doenças causadas por desidissordens do metabolismo do colágeno (1). Tais condições incluem hiper hiperpertireoidismo, hiperparatireoidismo, acromegalia, doença de Paget, osteomalacia, raquitismo, síndrome de Marfan, osteogênese imperfeita, esclerodactilia, dermatomiosite e síndrome de Cushing (2).

Fibrose que ocorre no fígado, pulmões, rins, pele e outros órgãos tem a capacidade de se desenvolver em hepatite crônica, esclerose hepática, câncer hepático, fibrose pulmonar e aglomerulonefrite (3). Portanto, prevenir o desenvolvimento e reduzir a gravidade da fibrose nos pacientes internados é muito importante. A hidroxiprolina atua como um importante indicador de diagnóstico da gravidade da fibrose.

A medida da hidroxiprolina no plasma, urina e tecido corporal é possível por métodos colorimétricos, cromatografia líquida de alta performance (HPLC) e análises de injeção de fluxo (4-6). Contudo, estes métodos requerem grandes volumes de amostra, devido à sua baixa sensibilidade. Além disso, a HPLCrequire um longo tempo de separação para cada amostra. Nos últimos anos, a cromatografia líquida – espectrometria de massa (LC-MS) tem surgido como vantajosa por sua alta sensibilidade e curto tempo de separação.LC-MS tem sido utilizado para medir baixas concentrações de drogas inseridas e urina com substâncias contaminadas (7-9). O presente estudo teve como objetivo aplicar o novo método LC-MS à medição temática da hidroxiprolina. Como indicador de fibrose,hidroxiprolina no fígado e pulmão de um modelo de fibrose de rato foi medido pelo LC-MS, e comparado com resultados anteriores obtidos por HPLC e métodos colorimétricos.

Materiais e métodos

Declaração ética

O protocolo de estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Harbin Medical University (Harbin, China). Um procedimento padrão para obtenção de consentimento livre e esclarecido por escrito foi incluído no protocolo e aprovado pelo Comitê de Ética da HarbinMedical University.

Reagentes

Dimethylnitrosamine (DMN) e hidroxiprolina foram obtidos da Nacalai Tesque Inc. (Harbin, China). (Kyoto, Japão). Nembutal foi comprada da Dai-Nihon Pharmaceuticals Inc. (Kyoto, Japão). (Osaka, Japão) e ableomicina foi obtida da Nihon Kayaku Inc. (Kyoto, Japão). (Tóquio, Japão). Outros produtos químicos foram de grau reagente.

Preparação de um modelo de fibrose pulmonar e de fígado em ratos

Um modelo de fibrose pulmonar foi criado em ratos Wistar de cinco semanas por injeção de bleomicina (BLM, 0,30U/100 g, i.Ratos saudáveis foram injetados com 0,9% de solução salina (controle).

Um modelo de fibrose hepática foi criado em ratos Wistar de sete semanas por injeção única de DMN (40 mg/kg,i.p.). Ratos normais saudáveis foram os controles e foram injetados com 0,9% de soro fisiológico (controle). A preparação do modelo de liverfibrose pulmonar e do tecido de coleta foi baseada nos métodos descritos nos estudos anteriores (10,11).

Medição da hidroxiprolina em um modelo de ratos de fibrose pulmonar pelo método colorimétrico

O pulmão esquerdo foi removido, pesado (~0.3 g) e homogeneizado em solução de ácido tricloroacético a 5% (volume x10) usando-se um homogeneizador de células (Eilard, Berlim, Alemanha) a 8.000 × g (4°C) durante 2 min em banho de gelo. As células foram centrifugadas (2.500 × g, 4°C) durante 20 min e o sobrenadante lavado duas vezes com água destilada. Então,6 N HCl foi adicionado a 110°C completamente no início e reagiu durante 16 h. Após a conclusão da reação, tolueno (3 ml) foi adicionado e a mistura foi agitada durante 20 min. Após a centrifugação (3.000 × g, 20°C) por 10 min, a camada orgânica foi coletada e o p-dimetilaminobenzaldeído adicionado. A hidroxiprolina na amostra foi detectada usando um espectrômetro MultiplateSpectrometer (Ultramark; Bio-Rad, Hercules, CA, EUA) a 560 nm.

Medição de hidroxiprolina no fígado por HPLC

O pulmão esquerdo foi removido, pesado (~0,3 g) e homogeneizado em 5 ml de etanol usando um homogeneizador de células (Eilard) a 8.000 × g (4°C) por 2 min em banho de gelo. O homogeneizado foi centrifugado (2.500 × g, 4°C) durante 20 min e o sobrenatantcolhido. O líquido (1 ml) foi obtido e aquecido por 8 h a 60°C até secar. Após a dissolução do resíduo em 40 μl etanol e 80 μl tampão borato (0,1 M, pH 8), 40 μl4-fluoro-7-nitrobenzofurazan (100 mM) foi adicionado como agente fluorescereagente. A reação pôde continuar à temperatura ambiente durante 15 h no escuro. Em seguida, foi adicionado 840 μl de ácido clorídrico (6 mol/l) para terminar a reação. Após centrifugação (2.500 × g, 20°C) durante 20 min, o sobrenadante foi removido para análise por HPLC.

A Hitachi L6000 HPLC (Hitachi HighTechnologies America, Inc., Schaumburg, IL, USA) foi usado. A detecção foi feita com um fluorescência-pectrómetro Hitachi L7480 (Hitachi High-Technologies Corporation, Tokyo, Japão; excitação a 475 nm, emissão a 530 nm). A coluna (HitachiHighTechnologies Corporation) foi um YMC Pack ODS-AQ (150×6,0 mmID) à temperatura ambiente. A fase móvel foi acetonitrila: água(35:65-50:50 gradiente durante 15 min) e a vazão foi de 1ml/min.

Medição da hidroxiprolina inpulmonar e organização hepática por LC-MS

O pulmão esquerdo foi removido, pesado (~0.3 g) ehomogenizado em solução de ácido tricloroacético a 5% (x10 volume) utilizando um homogeneizador de células (Eilard) a 8.000 × g (4°C) durante 2 min em banho de gelo. As células foram centrifugadas (2.500 × g, 4°C) durante 20 min. Este sobrenadante foi lavado duas vezes com água destilada. Em seguida, 6 N HClwas foram adicionados a 110°C durante 16 h e as amostras foram preparadas para a medição. O fígado foi removido, pesado (~0,3 g) e homogeneizado em 5 ml de etanol usando um homogeneizador de células (Eilard) a 8.000 × g (4°C) por 2 min em um banho de gelo. O homogeneizado foi centrifugado (2.500 × g, 4°C) por 20 min, o sobrenadante coletado e as amostras preparadas para medição.

A concentração de hidroxiprolina foi determinada seguindo um método LC-MS usando um sistema LC-MS2020 (Shimadzu Corp.,Kyoto, Japão). Em relação ao LC, a fase móvel foi de 5%CH3CN-10 mM CH3COONH4. O columnwas era Shin-pack VP-ODS (150×2 mm de diâmetro). A vazão foi de 0,2ml/min. Em relação à EM, foi empregada a ionização química atmosférica (APCI). Também foi utilizada a detecção positiva de íons. A tensão da sonda foi de 4,5 kV e a corrente da sonda foi de 4,2 μA. A temperatura da sondaAPCI foi de 250°C e a tensão eletrônica da linha curva de desolvação (CDL) foi de -30,0 V. A temperatura CDL foi de 250°C e a temperatura do bloco foi de 20°C. A tensão de polarização para os Q-arrays 1, 2 e 3 foi de 5,0, 25,0 e 35,0 V, respectivamente. A tensão eletrônica de RF para Q-array foi 150,0 V.

Análise estatística

As diferenças entre os grupos foram examinadas por análise de variância de via única. Se uma diferença significativa foi notada, a diferença entre os grupos foi examinada pelo método de Bonferroni. As correlações foram examinadas através de um teste bilateral. P<0,05 foi considerado para indicar uma diferença estatisticamente significativa.

Resultados

Medição da hidroxiprolineconcentração por LC-MS

Cromatograma de hidroxiprolina-MS

O espectro de massa da hidroxiprolina-massa é mostrado emFig. 2. MS do padrão de hidroxiprolina (80 pg/ml) resultou em picos de fragmentos com uma massa molecular de 173,0 (íon molecular + ácido acético-água) gerada de adição ao ácido acético amônio para aumentar o número de moléculas iônicas (quantidade molecular, 131,15) e força iônica.

Cromatograma de hidroxiprolina da LC-MS

As condições de LC foram as seguintes: Fase móvel, 5%CH3CN-10 mM CH3COONH4; coluna, Shin-pack VP-ODS (150×2 mm de diâmetro); taxa de fluxo, 0,2 ml/min e detecção de andultravioleta (UV) a 230 nm. A MS foi realizada pelo método de ionizaçãoAPCI e a detecção de íons foi positiva.

O cromatograma de monitorização de íons (SIM) de hidroxiprolina (m/z, 173,0) selecionado pelo LC-MS é apresentado na Fig. 3. Como observado para o padrão de hidroxiprolina, um pico foi observado a 1 ng/ml em um tempo de retenção de 2,213 min. Um pico acentuado também foi observado a 50 ng/ml. A 1 μg/ml,que foi 1.000× a concentração padrão, um pequeno pico foi observado no espectro LC-UV (230 nm).

Sensibilidade da detecção de LC-MS à hidroxiprolina

A curva padrão LC-MS-SIM de hidroxiprolina(m/z, 173,0; íon molecular + ácido acético-água) é mostrada emFig. 4. Usando o método de área de pico para a curva padrão, a hidroxiprolina exibiu um pico agudo a 35ng/ml (Fig. 3). Entretanto, atconcentrações <35 ng/ml, uma correlação entre as áreas dos picos não foi observada. De 35-560 ng/ml, uma correlação entre as áreas dos picos foi observada e a curva padrão foi uma linha reta. Aos 60 e 80 μg/ml, as áreas dos picos eram quase idênticas. Uma correlação entre as áreas dos picos não foi observada em concentrações >60 μg/ml.

CromatogramaLC-MS e espectro de MS de hidroxiprolina em um modelo de fibrose pulmonar e hepática em ratos

Fig. 5 mostra o cromatogramaLC-MS e espectro de MS com detecção SIM de hidroxiprolina (m/z 173,0; íon molecular + acético-água) em um modelo pulmonar de fibrose em ratos. No cromatograma LC-MS do pulmão, semelhante ao do padrão de hidroxiprolina, foi observado um pico distinto em m/z 173,0 no tempo de aretenção de 2.213 min. A hidroxiprolina foi identificada atm/z 131,15 no espectro de massa.

Fig. 6 ilustram o cromatograma LC-MS e o espectro MS com detecção SIM da hidroxiprolina (m/z 173,0; íon molecular + acético-água) no tecido fibrótico hepático de ratos. Como observado para o padrão de hidroxiprolina, um pico foi observado em um tempo de retenção de 2,213 min no cromatograma LC-MS e no espectro MS.

Concentração da hidroxiprolina no pulmão (colorimétrica e métodos LC-MS)

Métodos colorimétricos e LC-MS utilizados para a determinação da concentração de hidroxiprolina no pulmão de ratos são comparados na Fig. 7.Cada coluna representa a média ± desvio padrão de neexperimentos. De acordo com o método colorimétrico, a concentração de hidroxiprolina no tecido pulmonar de ratos no grupo de BLM (652,3±70,0 μg/ pulmão esquerdo) foi significativamente maior em comparação com o do grupo controle (547,1±52,3 μg/ pulmão esquerdo;P<0,05). De acordo com o método LC-MS, o grupo infuso de BLM(610,9±50,3 μg/ pulmão esquerdo) teve um valor significativamente maior comparado com o grupo controle (493,3±53,5 μg/ pulmão esquerdo; P<0,05).Entretanto, a concentração de hidroxiprolina no tecido pulmonar de ratos medido pelo método LC-MS teve um valor menor comparado com o medido pelo método colorimétrico.

As concentrações de hidroxiprolina no tecido pulmonar de ratos medido pelo método colorimétrico e LC-MS são comparadas na Fig. 8. Uma correlação entre os métodos colorimétrico e LC-MS para a determinação da concentração de hidroxiprolina no tecido pulmonar do grupo controle foi identificada (r=0,972). Similarmente, foi identificada uma correlação entre os métodos colorimétrico e LC-MS para a determinação da concentração de hidroxiprolina no tecido pulmonar do grupo BLM-infused (r=0,918).

Concentração de hidroxiprolina no tecido hepático de ratos através de marcação por fluorescência e métodos LC-MS

A avaliação da concentração de hidroxiprolina no tecido hepático de ratos através de marcação por fluorescência e métodos LC-MS é ilustrada na Fig. 9. De acordo com o método de marcação por fluorescência, a concentração de hidroxiprolina no tecido hepático de ratos do grupo DMN-infusão(105,4±36,5 μg/g) foi significativamente maior em comparação com o grupo controle (30,3±2,7 μg/g; P<0,05). Ainda de acordo com a análise daLC-MS, o grupo infuso de DMN (190,4±70,3 μg/g) demonstrou um valor significativamente maior em comparação com o grupo controle (62,4±6,8 μg/g; P<0,05). Entretanto, a hidroxiprolineconcentração no tecido hepático de ratos medida pelo método LC-MS foi maior -comparada com a medida pelo método de marcador de fluorescência.

A concentração de hidroxiprolina-concentração no tecido hepático de ratos avaliada pelo marcador de fluorescência e métodos LC-MS estão correlacionados na Fig. 10. A concentração de hidroxiprolineconcentração no tecido hepático do grupo controle avaliada por meio da marcação por fluorescência correlacionada com a obtida pelo métodoLC-MS (r=0,957). Também, a concentração de hidroxiprolina no tecido hepático do grupo DMN-infusão obtida pelo método de marcação por fluorescência correlacionou-se com a obtida usando o método LC-MS (r=0,981).

Discussão

Hidroxiprolina é um tipo de aminoácido encontrado no inalbúmen. O resíduo da prolina na proteína é hidroxilado por 4-monooxgenase para gerar ácido 4-hidroxi-2-oxoglutal, que é convertido em alanina e glicina via ácido 4-glutâmico no corpo humano. Em cada órgão interno do corpo, inflamação e fibrosisia dão origem ao acúmulo de componentes da matriz extracelular (ECM) (12). No entanto, sob condições patológicas, pode ocorrer fibrose adicional no fígado, pulmões e rins (13,14).A hepatite crônica e a esclerose hepática estão associadas à fibrose e também têm estreita correlação com o câncer de fígado (15).

Nos pulmões, a gravidade da fibrose é dependente do tipo de pneumonia (16). Fibrose nos órgãos internos causada pela proliferação de componentes ECM depositados bymyofibroblastos. Entendendo o desenvolvimento da fibrose envolvendo o exame da concentração de colágeno. A hidroxiprolineconcentração está associada ao colágeno como um indicador da severidade da fibrose (18-20). A hidroxiprolina é importante como um índice da doença causada pela proliferação de colágeno (como infibrose) e mau funcionamento do metabolismo.

Nos últimos anos, a LC-MS demonstrou ser um método de detecção altamente sensível (7,8,21).LC-MS compreende um componente LC e EM, e a interface que os conecta. A peça LC é idêntica à HPLC convencional. A amostra é ionizada pela secção da interface. A ionização por termospray produziu produtos instáveis (voláteis), de modo que a APCI foi utilizada (whichionizes material, mas não o solvente, após nebulização com solvente sob pressão atmosférica). A ionização por eletrospray (ESI) pode ser usada para ionizar moléculas de alta polaridade e alto peso molecular, o que é ideal para o componente de interface, porém, no presente estudo, o ESI não foi adaptado para a medição da hidroxiprolina em amostras de corpo, pois o ESI não foi acompanhado pelo termospray em caso de ionização. Foi um procedimento mais simples para medir a hidroxiprolina combinada com Na+ adicionando Na+ adicional a esta amostra.

O espectro MS da hidroxiprolina demonstrou picos de m/z 173.0 e 131.15. m/z 173.0 foi identificado a partir do pico representando o sal acético-ácido originário do ácido acético amônico que foi adicionado à fase móvel para aumentar a resistência. Além disso, devido à resistência comparativa de m/z 131.15 e 173.0 ser aproximadamente idêntica no espectro MS, o íon de m/z 173.0 foi escolhido pelo SIM no cromatograma MS a fim de evitar o pico de interferência da fase móvel.

No cromatograma MS do padrão hidroxiprolina a 1 ng/ml, um pico foi observado na medição do SIM com m/z 173.0. No espectro UV (230 nm) da hidroxiprolina a 1 μg/ml, que foi 1.000× a concentração padrão, foi observado um pequeno pico (a medição foi realizada ao mesmo tempo que a medição LC).

Em concentrações <35 ng/ml, entre as áreas de pico, não foi observada uma forte correlação entre os diferentes métodos, e não foi possível criar uma curva padrão. Foi possível perceber que o analito pode ter sido afetado pelo pico da fase móvel, já que a hidroxiprolina tem um peso molecular comparativamente baixo (131,15). Além disso, o tempo de retenção do pico pode ter se tornado instável devido à polaridade do solvente em baixas concentrações (concentração de hidroxiprolina <35 ng/ml).

Foi feita a hipótese de que pode ser possível tomar concentrações de substâncias tão baixas quanto o nível de pg/ml. Para o pico de hidroxiprolina no cromatograma de EM, o tempo de retenção foi curto (2.213 min). A capacidade da hidroxiprolina de se manter na coluna ODS foi mais fraca do que o proposto originalmente. A resistência relativa do íon no espectro MS em m/z 131,15 e 173,0 foi aproximadamente idêntica e, portanto, o pico de interferência da fase móvel escolheu um íon de m/z173,0. No cromatograma LC-MS de hidroxiprolina no tecido pulmonar e hepático, foi observado um pico agudo de m/z 173,0 no tempo de aretenção de 2,213 min, assim como para o padrão de hidroxiprolina. Com relação ao espectro de MS, foi confirmado o pico de íon molecular de hidroxiprolina (m/z 131,15).

A medição da concentração de hidroxiprolina nos tecidos pulmonar e hepático por LC-MS foi comparada com a obtida pelo método colorimétrico, assim como um método de fluorescência usando HPLC de um estudo anterior do nosso grupo. Foi observada uma correlação positiva altamente significativa. No entanto, o valor da hidroxiprolineconcentração no pulmão obtido pelo método colorimétrico foi superior ao obtido pelo LC-MS. Além disso, a hidroxiprolineconcentração no fígado obtida pelo método de fluorescência utilizando HPLC foi menor quando comparada com o valor obtido pelo LC-MS (que deveria ser uma alta absorvância de todos os componentes na amostra a um comprimento de onda constante de 560 nm).

Em conclusão, a hidroxiprolineconcentração, como indicador de offibrose, foi medida pelos métodos colorimétrico e HPLC em estudos prévios do nosso grupo. Em comparação, o presente estudo identificou que o método LC-MS foi mais vantajoso, caracterizado por processo simples, alta sensibilidade (nível de pg) e tempo de separação curto. Outras investigações com amostras maiores são necessárias para confirmar estes resultados.

Acknowledgements

Os autores agradecem a M. Kusunose, M. Ono andA. Hamada (Departamento de Farmácia, Kochi Medical School, Kochi,Japão) por fornecer vários reagentes utilizados neste estudo, sugestões úteis e conhecimentos técnicos. Este trabalho foi financiado pelo Departamento de Saúde Pública da Província de Heilongjiang (no. 2013365) da China.

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