Disfomos de fontes de glicose, glicose e nutrientes glutamínicos para decifrar o fluxo de carbono em células K562 e alterações em resposta ao tratamento BaP. No geral, observamos a maior quantidade de incorporação de rótulos nas ribose moieties e lactato (veja e arquivo adicional 1: Figura S1 para detalhes sobre as distribuições de rótulos). Conforme ilustrado na Figura 1, a incorporação de etiquetas no ciclo de Krebs resultante da glucose pode produzir dois padrões de rotulagem distintos dos metabolitos do ciclo de Krebs, dependendo se o fragmento C2 entra através da carboxilase piruvada (PC) ou da desidrogenase piruvada (PDH). O piruvato formado a partir da glicose irá produzir glutamato via PDH, mas glutamato via atividade do PC. Como a atividade do PC produz oxaloacetato a partir do piruvato, espera-se malato derivado do PC, enquanto que o produto PDH será malato ou malato.

NMR espectros indicam que grandes quantidades de aspartato e malato são derivados de PC

Como mostrado na Fig. 2, são observadas diferenças significativas entre as células que processam glicose durante 3 vs. 24 h para as ressonâncias de malato e aspartato. Essas diferenças se manifestam predominantemente em uma mudança de constantes de acoplamento de RMN. O tamanho dessas constantes de acoplamento depende da natureza do átomo de carbono adjacente: um grupo ácido carboxílico produz uma constante de acoplamento muito maior do que um grupo CH2. A constante de acoplamento para a fracção 13C1 13C2 em aspartato ou malato é cerca de 50-60 Hz enquanto que a constante de acoplamento para a fracção 13C2 13C3 é cerca de 35-40 Hz.

Para um período de rotulagem de 24 h, a Fig. 2 mostra constantes aparentes de acoplamento de 53 Hz para C2 de malato e aspartato. Esta grande constante de acoplamento aparente mostra que o acoplamento de C2 com o grupo adjacente de ácido carboxílico C1 predomina. Este padrão de acoplamento 13C1 13C2 (e também 13C3 13C4, ver ficheiro adicional 1) surge da actividade PDH e possivelmente também dos metabolitos que passam várias vezes pelo ciclo de Krebs para um período de rotulagem mais longo.

Para o curto período de rotulagem de 3-h, as constantes de acoplamento aparentes menores de 47 e 41 Hz são observadas para C2 (Fig. 2 e ficheiro adicional 1: Figura S1), indicando que o acoplamento com o metileno C3 adjacente domina. A presença da fracção de 13C2 13C3 em períodos de rotulagem mais curtos mostra que o produto resultante da actividade do PC domina durante períodos de rotulagem mais curtos.

De notar que as fracções de sinal observadas não representam as constantes de acoplamento escalares precisas numa mistura de compostos rotulados. Entretanto, a mudança observada fornece uma clara indicação de maiores quantidades do produto PC em períodos de rotulagem mais curtos, tanto no malato quanto no aspartato.

Outras evidências da atividade PC no subespectro do uracilo

Na síntese de pirimidina de novo, o uracilo é formado a partir do aspartato via carbamoyl-aspartato, orotato e di-hidroorotate. Portanto, os padrões de rotulagem em aspartato devem ser refletidos em sinais de anel de pirimidina. Arquivo adicional 2: A figura S2 mostra as incorporações esperadas de rótulos para o uracil. Quando a base do uracil no UDP é sintetizada a partir do aspartato, o destino dos 13Cs é o seguinte: C1, C2 e C3 do aspartato tornam-se respectivamente C10, C11 e C12 do UDP enquanto C4 é perdido (ver ficheiro adicional 2). Nos espectros HSQC, apenas C11 e C12 podem ser observados diretamente, pois C10 não tem um próton anexado.

Para amostras com glucose-labelado, o aspartato derivado de PC será C2C3-rotulado. Isto é convertido para um fragmento C11C12 etiquetado no UDP. No entanto, o aspartato derivado do PDH pode ser rotulado em C1C2 ou C3C4. Isto se traduz em C10C11 ou C12 isolado em uracil, respectivamente. Portanto, os espectros de C12 são indicativos de quantidades relativas de atividade PC vs. PDH; PC produz um doublet para C12, enquanto PDH produz um singlet em C12.

Todos os espectros mostraram os sinais singlet e doublet em C12 (Fig. 3). No entanto, a intensidade do doublet em relação ao singlet mudou entre 3 e 24 h de dados por um fator de três, indicando novamente uma mudança da rotulagem mediada por PC para PDH com o tempo. A imagem que emerge de vários metabolitos é que existe uma actividade paralela do PC e do PDH, mas o produto PC é principalmente canalizado para produtos directamente ligados ao oxaloacetato, produzindo a elevada quantidade observada de produto PC nestes metabolitos numa exposição de curto prazo. Apenas em períodos de rotulagem mais longos o produto PDH é observado no ramo esquerdo do ciclo de Krebs.

BaP-O malonato induzido é derivado da atividade PC a jusante em células K562

Demos a entender que o malonato pode ser formado a partir do oxaloacetato por conversão química sob a influência do peróxido de hidrogênio e sugerimos em nosso estudo anterior que o acúmulo de malonato em resposta ao tratamento BaP era impulsionado pela elevação induzida pelo tratamento de ROS atuando sobre o oxaloacetato. Amostras foram perfuradas com malonato para confirmar nossa atribuição das ressonâncias do metileno 1H/13C em espectros de HSQC (ver arquivos adicionais 3 e 4). Subsequentemente, neste estudo, a nossa abordagem baseada no rastreador permitiu-nos considerar as origens do malonato observado.

Como mostrado na Fig. 4a, malonato derivado de oxaloacetato que tinha sido formado diretamente de piruvato pela atividade do PC usando glicose como fonte nutritiva seria esperado que fosse rotulado nas posições C1 e C2. Na situação alternativa em que a atividade PDH converte o piruvato em acetil-coA ao entrar no ciclo de Krebs, seria esperado que a conversão do oxaloacetato resultante em malonato, mediada por ROS, desse origem a dois produtos com rótulo na posição C1 ou nas posições C1 e C2 numa proporção de 1:1 porque o ciclo de Krebs passa por succinato e fumarato simétricos (ver também Fig. 1).

Figure 4b mostra uma fatia 1D representativa de espectros de HSQC provenientes de células glucosadas tratadas com BaP 24 h e demonstra claramente a geração induzida por drogas de um forte sinal de malonato. Nos espectros HSQC correspondentes, provenientes de células glucosadas tratadas com BaP 24 h, observamos um doublet claro (Fig. 4c mostrado como picos vermelhos) com uma divisão de 58 Hz, indicativo de um grupo CH2 rotulado acoplado a um carbono ácido carboxílico. Esta é uma clara indicação de um malonato C1,C2 (ou C2,C3) rotulado com etiqueta em apenas um dos dois grupos de ácido carboxílico. O malonato rotulado em todas as três posições que poderiam surgir de múltiplas passagens através do ciclo de Krebs seria esperado que mostrasse um trigêmeo no C2 na dimensão 13C dos espectros HSQC, pois pelo menos alguma porcentagem seria rotulada em ambos os grupos COO (padrão de acoplamento AX2). Portanto, a ausência de um sinal central no HSQC é altamente indicativo de que o malonato é derivado da atividade do PC a montante. A ausência de malonato derivado de múltiplos ciclos de Krebs e atividade PDH também é suportada pelo fato de que o malonato resultante de 24 h de rotulagem de células tratadas com BaP com glicose mostrou apenas um único t (Fig. 4c mostrado como pico azul).

A fim de provar ainda mais que o malonato induzido por drogas é derivado a jusante da atividade PC, adquirimos espectros 13C-1D nos quais pudemos observar as ressonâncias COO do malonato diretamente (Fig. 4d). Um espectro de referência de 10 mM de ácido malônico no mesmo tampão (pH 7) utilizado para extratos celulares confirmou a freqüência da ressonância COO (Fig. 4d).

rotulagem mediada por PC deve produzir um doublet em C1 (decorrente do malonato), enquanto que a rotulagem mediada por PDH deve dar uma mistura de 50:50 de um doublet decorrente do malonato e um singlet decorrente do malonato (Fig. 4a). Embora ruidosos mesmo após 24 h de aquisição, os espectros derivados mostraram um doublet claro sem sinal residual no meio (Fig. 4d) confirmando que o produto de rotulagem derivado do PC é dominante. A partir disto, concluímos que o malonato é de facto derivado da conversão do oxaloacetato mediado por ROS originado inteiramente ou pelo menos predominantemente da actividade do PC e não mostra qualquer contribuição de um possível produto PDH mesmo após um período de 24 h de rotulagem. As experiências de controlo utilizando glutamina como fonte de carbono mostraram apenas uma incorporação mínima da etiqueta no malonato. O malonato produzido a partir da glicose mostrou ser predominantemente rotulado via PC. Juntos, esses dois fatos sugerem fortemente que o malonato é produzido predominantemente a partir de glicose via glicólise e entrada mediada por PC do piruvato no ciclo TCA.

Atividade paralela de PDH

Tabela 1 compara constantes de acoplamento de 1 J CC e padrões de intensidade múltipla observados nos conjuntos de dados rotulados de 3 e 24 h. Tanto nos conjuntos de dados de 3 e 24 h, a etiquetagem no glutamato C4 é muito maior do que a etiquetagem em C4 e a divisão vista em C4 indica acoplamento a C5. Isto sugere fortemente que a rotulagem mediada por PDH é dominante para o glutamato em ambos os pontos de tempo. O citrato C2 é dividido por um grande acoplamento a C1, mais uma vez sugerindo fortemente que a etiquetagem mediada por PDH é dominante. Estes padrões de rotulagem indicam uma clara dominância dos produtos PDH para o ramo direito do ciclo de Krebs, levando do citrato ao glutamato.

Análise de múltiplos computacionais

Slices do 1H-13C-HSQC também foram quantitativamente analisados simulando espectros do 13C-NMR para uma mistura de diferentes isotopômeros usando o software pyGamma do software NMRLab . Para o glutamato, a análise de múltiplos t confirmou que a rotulagem mediada por PDH era dominante tanto em 3 como em 24 h, independentemente do tratamento BaP. Para o aspartato, a análise de múltiplos confirmou que houve uma mudança da rotulagem mediada por PC às 3 h para a rotulagem mediada por PDH às 24 h. Os espectros simulados são mostrados no arquivo adicional 5: Figura S4, e a Tabela 2 confirma resultados qualitativos para aspartato e glutamato.