Em 1440 o sacerdote italiano, humanista, reitor e orador Lorenzo Valla circulou no manuscrito De falso credita et ementita Constantini Donatione declamatio, provando por razões históricas e linguísticas que a Doação de Constantino era uma falsificação. Por causa da oposição da igreja, o ensaio não foi publicado formalmente no papel até a edição de Ulrich von Hutten de 1517. Ele se tornou popular entre os protestantes, e uma tradução inglesa foi publicada para Thomas Cromwell em 1534. Valla argumentou o seu caso de forma tão convincente que ainda hoje se mantém, e a ilegitimidade da Doação de Constantino é geralmente concedida.

Valla mostrou que o documento não poderia ter sido escrito na era histórica de Constantino I (século IV) porque o seu estilo vernáculo datava conclusivamente de uma era posterior (século VIII). Uma das razões de Valla foi que o documento continha a palavra satrap que ele acreditava que Romanos como Constantino I não teriam usado.

Embora inicialmente recebeu grandes críticas, a Doação de Constantino foi aceita como legítima, especialmente por causa da natureza benéfica de seu conteúdo para a igreja ocidental. A Doação de Constantino sugeriu que Constantino I “doou” todo o Império Romano Ocidental à Igreja Católica Romana como um ato de gratidão por ter sido miraculosamente curado da hanseníase pelo Papa Silvestre I. Isto teria obviamente descontado a Doação de Pepin, o Curto, que deu terras aos Lombardos ao norte de Roma.

“Valla foi motivado a revelar a Doação de Constantino como uma fraude por seu empregador da época, Alfonso de Aragão, que estava envolvido num conflito territorial com os Estados Papais, então sob o Papa Eugênio IV. A Doação de Constantino tinha sido frequentemente citada para apoiar o poder temporal do Papado, desde pelo menos o século XI” (artigo da Wikipédia sobre Lorenzo Valla, acessado em 01-17-2009).