2.2 Estratégias de Produção para Levan

Levan é sintetizado como um exopolissacarídeo (EPS) na matriz extracelular de bactérias de vários gêneros, tais como Acetobacter, Aerobacter, Azotobacter, Bacillus, Corynebacterium, Erwinia, Gluconobacter, Mycobacterium, Pseudomonas, Streptococcus e Zymomonas (Sarilmiser et al., 2015). Além desses produtores de levan extremófilo, Poli et al. (2009) reportaram Halomonas sp. como produtor de levan. Outros estudos sobre o uso potencial de Halomonas levan como agente biofloculante (Sam et al., 2011), peptídeo e sistema de administração de drogas baseado em proteínas (Sezer et al., 2011, 2015), magro biocompatível (Sima et al., 2011, 2014), filme adesivo multicamadas (Costa et al., 2013), e um glicano heparina-mimador (Erginer et al., 2016) foram investigados. Fig. 12.2 mostra o processo geral de produção de levan microbiano.

Figure 12.2. Passos Básicos de Processamento Downstream para Levan.

SPE microbianos são normalmente produzidos em sistemas de fermentação aeróbica, submersa. Condições de fermentação, tais como aeração, agitação, pH, concentração de oxigênio dissolvido, temperatura, composição média e projeto do biorreator podem determinar as características do produto e o rendimento da produção. Assim, para se obter uma alta qualidade de produção e um rendimento elaborado, a otimização desses parâmetros deve ser realizada para cada organismo (Öner et al., 2016). Por exemplo, Srikanth et al. (2015) investigaram os efeitos dos parâmetros de fermentação, incluindo pH inicial, suplementação com levan, concentração de sacarose, fonte de nitrogênio, concentração de inóculo e tempo de cultivo na síntese de levan usando Acetobacter xylinum NCIM2526 como cepa produtora. As condições ideais foram determinadas como 10, 50-60, e 1,49 g/L para nitrogênio, sacarose e inóculo, respectivamente. O rendimento do levan aumentou notavelmente após as primeiras 24 h e a produtividade máxima do levan foi obtida após 122 h, quando o pH inicial foi fixado em 6,8. O aumento da suplementação inicial de levan de 0,1 para 0,4 g/L aumentou a produção de levan de 1,22 para 1,65 g/L; qualquer coisa acima de 0,4 g/L não teve mais aumento na produção. Concentrações de inoculum entre 5% (v/v) e 10% (v/v) resultaram em uma mudança no rendimento de levan como esperado e um rendimento máximo (1,46 g/L) foi alcançado a 7% (v/v). Concentrações de sacarose de 20 a 80 g/L afetaram o rendimento de levan. Na faixa de 40-50 g/L a produção foi aumentada, na faixa de 70-80 g/L foi diminuída, e na faixa de 20-40 g/L não foi alterada.

Sarilmiser et al. (2015) estudaram a produção de levan em um microorganismo halofílico (Halomonas smyrnensis AAD6T) usando vários fatores estimulantes. Por exemplo, várias estratégias de alimentação foram aplicadas em diferentes intervalos de tempo em um sistema de biorreator descontínuo, e múltiplas condições iniciais foram testadas em culturas de agitação. Entre as diferentes concentrações de pH e sacarose testadas, o rendimento máximo de levan foi alcançado com pH 7 (1,345 g/L levan) e 50 g/L de sacarose (1,320 g/L levan). Quando limitações de nitrogênio e fósforo foram aplicadas, tanto a concentração de levano quanto a biomassa foram diminuídas, enquanto os valores de Yp/x foram aumentados. As estratégias de pulso de nitrogênio diminuíram a síntese de levan devido ao longo período de crescimento, as estratégias de pulso de sacarose melhoraram significativamente o crescimento celular e a produção de levan, e o pulso de NaCl não teve impacto no crescimento. Curiosamente, as culturas cultivadas na presença de ácido bórico produziram as maiores concentrações de levan (8,84 g/L) em condições controladas de biorreator. Esta melhoria foi explicada pelo fenômeno biológico conhecido como quorum sensing (QS), no qual átomos de boro estão envolvidos; uma das moléculas sinalizadoras envolvidas em QS em H. smyrnensis AAD6T foi posteriormente identificada como uma C16-acylhomoserinelactona (Abbamondi et al., 2016).

O peso molecular do levan é um fator decisivo na sua aplicabilidade em várias indústrias, incluindo as indústrias alimentícia, cosmética e médica (Belghith et al., 1996). A determinação das condições otimizadas para a produção de levan é vital para a obtenção do composto de peso molecular desejado (Porras-Domínguez et al., 2015). Por exemplo, Wu et al. (2013) avaliaram modificações sutis no processo de produção para adquirir diferentes pesos moleculares de levan em sistemas batch e fed-batch, usando Bacillus subtilis (natto) Takahashi como a estirpe produtora. Quando altas (400 g/L) e baixas (20 g/L) concentrações de sacarose foram aplicadas, obtiveram-se menores e maiores pesos moleculares de levan, respectivamente. Esta relação linear foi atribuída ao efeito da sacarose sobre a enzima levansucrase. Os autores concluíram que o peso molecular do levan dependia das condições de reação, como pH, temperatura, velocidade de agitação e sacarose, sendo esta última o fator mais efetivo na determinação do peso molecular do levan.

A produção de levan em sistemas celulares imobilizados também é vantajosa, uma vez que tais sistemas se beneficiam de processos relativamente fáceis a jusante, alta produtividade volumétrica, controle avançado do processo e risco reduzido de contaminação na produção de EPS (Ürküt et al., 2007). A implementação deste método favorável para a produção de levan pode ser utilizada como alternativa aos processos batch, feed-batch e contínuo (Öner et al., 2016). Por exemplo, Silbir et al. (2014) testaram a produção de levan em sistemas de fermentação batch e contínua usando Zymomonas mobilis B-14023. As produções de fermentação contínua foram realizadas em um biorreator de leito embalado empregando células Ca-alginato imobilizadas. Tempo de incubação, pH inicial e concentração do substrato foram as três variáveis de processo mais significativas para a produção em sistema descontínuo de levan. A maior quantidade de levan (40,2 g/L) foi produzida quando o extrato de levedura foi usado como fonte de nitrogênio orgânico em culturas de frascos de agitação. Além disso, células Z. mobilis imobilizadas no sistema de fermentação contínua foram aplicadas com sucesso para a produção de levan. Quedas incontroláveis na pressão do sistema e ruptura de contas de gel de Ca-alginato foram as maiores limitações para tempos de fermentação mais longos.

Embora a diversidade de microrganismos produtores de levan, os custos de produção de polissacarídeo de levan permanecem altos. Este é provavelmente o maior gargalo na sua comercialização (Öner et al., 2016; Sarilmiser et al., 2015). Os meios de fermentação representam aproximadamente 50% dos custos de produção de um processo microbiano (Van Hoek et al., 2003); entretanto, fontes baratas de carbono, como xaropes e melaços, já foram usadas anteriormente para a produção de levan microbiano (Özcan e Öner, 2015). Kucukasik et al. (2011) investigaram o melaço de beterraba sacarina e o melaço de amido como substitutos da sacarose em culturas Halomonas. Clarificação, pH, ácido sulfúrico, fosfato tricálcico e pré-tratamentos com carvão ativado foram usados em diferentes combinações para ajustar a disponibilidade química para a produção de levan. Concluiu-se que o rendimento máximo de levan em 10 g/L de concentração TCPHAC é de 4,19 e 3,68 g/L, respectivamente. Ao usar 30 g/L de TCPHAC e HAC, foram alcançados rendimentos de levan de 7,56 e 4,44 g/L. A remoção de metais pesados e o aumento da concentração de ferro resultaram em uma diminuição da integridade celular e do rendimento de levan neste estudo. Em outros estudos, o melaço de cana blackstrap em culturas de Bacillus lentus V8 (Abou-Taleb et al., 2015), xarope de data em culturas de Mycobacterium levaniformis 1406 (Moosavi-Nasab et al., 2010), melaço de beterraba em culturas de Paenibacillus polymyxa NRRL B-18475 (Han e Watson, 1992), e melaço e xarope de cana em culturas de Z. mobilis ATCC 31821 (De Oliveira et al, 2007) foram investigadas como fontes de baixo custo de carbono para produção de levan.

Biossíntese de levan em sistemas de fermentação submersa são limitadas pela exigência de crescimento celular que pode não atender às condições ideais para alta atividade levansucrase (Santos-Moriano et al., 2015). Entretanto, sistemas sem células removem essa limitação e oferecem benefícios adicionais, tais como fácil preparação, reusabilidade e controle de mudanças microambientais (Jang et al., 2001). Por esta razão, proporcionar um ambiente ideal para a levansucrase é crucial. Por exemplo, Lu et al. (2014) examinaram a influência de vários fatores, como concentração do substrato, tempo de reação, temperatura e pH na produção de levan utilizando levansucrase recombinante em um sistema livre de células. Eles observaram um rendimento máximo de levan (7,1 g/L) usando sacarose 0,8 M, pH 6,5, e 40°C por 24 h. O rendimento de levan aumentou paralelamente com um aumento na concentração de sacarose de 0 para 0,8 M. Seu estudo mostrou que a enzima recombinante exibe propriedades bioquímicas similares à enzima nativa.