Biological Assays of Bradykinin and Related Kinins

Kinins are potent hypotensive agents in all animal species studied (54). O teste in vivo mais comum para estes peptídeos é a pressão arterial de ratos, descrita anteriormente. Os efeitos vasodilatadores das cininas são medidos em órgãos perfusos isolados com endotélio intacto, de acordo com o procedimento descrito na Seção IV. O efeito relaxante das cininas nos vasos arteriais é avaliado in vitro na artéria carótida do cão (57) usando o método descrito por Regoli e Barabé (34). O efeito venoconstritor é medido in vitro na veia jugular do coelho (42), de acordo com o procedimento resumido abaixo.

As veias, retiradas de coelhos (1,0-2,0 kg), são cortadas em tiras helicoidais de 2 mm de largura e 2 cm de comprimento e suspensas em solução de Krebs (oxigenada a 37°C) contendo um inibidor enzimático convertedor (Captopril, 10 μM) para prevenir a degradação dos parentes (34). As contracções dos tecidos em resposta aos quininos são registadas conforme descrito anteriormente e as curvas concentração-resposta completas são geralmente medidas para avaliar as afinidades dos quininos e seus antagonistas. Foi demonstrado que a veia jugular do coelho contém um subtipo receptor B2 (B2A) (Tabela V).

A preparação não vascular mais comumente utilizada é o íleo de cobaia, que é retirado de cobaias de 250-350 g e preparado como uma faixa muscular lisa longitudinal, de acordo com Rang (37). O tecido é suspenso in vitro em solução de Krebs (oxigenado a 37°C) e as suas alterações de tensão são medidas conforme descrito acima para os vasos isolados (ver secção I). O íleo de cobaia é a preparação utilizada para caracterizar o subtipo de receptor B2B (Tabela V).

B1 receptores são estudados utilizando a tira de aorta de coelho, preparada e manipulada da mesma forma que para a angiotensina. O tecido é quase insensível aos quininos, particularmente ao desArg9BK, o agonista do receptor Bt, no início do experimento. A sensibilidade do tecido aumenta ao longo de várias horas (até 6-10 hr) de incubação à medida que os receptores B1 são formados de novo (55). Os efeitos contráteis das cininas são registrados e analisados usando os mesmos instrumentos e abordagens descritos na Seção I para angiotensina. Os tecidos do coelho podem ser sensibilizados ao desArg9BK pelo pré-tratamento dos animais com lipopolissacarídeo (LPS), que é injetado por via intravenosa 5 hr antes de matar o animal (56). O mecanismo de geração de receptores B1 pelo LPS tem sido investigado (60, 61). As aortas e outros tecidos retirados de coelhos tratados com LPS respondem ao desArg9BK desde o início da incubação in vitro (56). Da mesma forma, artérias renais caninas expressam receptores B1 espontaneamente e mostram alta sensibilidade ao desArg9BK (62).

Compostos transversais têm sido usados para caracterizar receptores de quinina em órgãos isolados, usando as respostas biológicas (contráteis) de três preparações (Tabela V). Bradicininas e kallidin são potentes estimulantes da veia jugular do coelho (RJV) e do íleo de cobaia (GPI), enquanto desArg9BK e Lys,desArg9BK são inativos. A ordem oposta de potência é observada na aorta do coelho (AR). desArg9BK é um antagonista somente na AR. Sobre estas bases, Regoli e Barabé (54) propuseram a hipótese dos dois receptores parentes, a B1 (AR) e a B2 (RJV, GPI, e muitas outras preparações e testes) que foi caracterizada inicialmente apenas com agonistas (54) e posteriormente (ver abaixo) foi caracterizada com antagonistas. Os antagonistas dos receptores B2 foram identificados por Vavrek e Stewart (63) e posteriormente melhorados por vários investigadores (64-66) pela substituição de Pro3 por hidroxiprolina (Hyp), pela adição de um d-Arg ao terminal N, pela substituição de Phe8 por Leu e pela substituição do dipeptídeo Pro7-Phe8 por d-Tic-Oic (67-69). Um protótipo de cada série antagonista é relatado na Tabela V para indicar que b-2-tienil-elanina (Thi) não é necessária nas posições 5 e 9, enquanto Hyp3 e d-Arg0 são importantes para afinidade, particularmente no RJV. A substituição de Phe8 por Leu, somada às outras modificações, leva ao d-ArgBK, que (a) é quase desprovido de atividade agonística, e (b) é ativo no RJV, menos ativo no GPI, e bastante pobre na AR (B1), sendo, portanto, bastante seletivo para o site B2. A diferença entre os valores do pA2 (por duas unidades log) entre o RJV e o GPI é um achado determinante para a subdivisão proposta (Tabela V) dos receptores B2 em B2A (RJV) e B2B (GPI). D-ArgBK é um antagonista competitivo, rapidamente reversível tanto in vivo quanto in vitro e é diferente de Hoe 140, que é não competitivo (nonequilibrium), provavelmente porque tem uma interação prolongada com os sítios B2A e B2B (59, 67, 68, 70). A distinção entre B2A e B2B é suportada pelos resultados obtidos com os dois últimos compostos (Tabela V), que diferem pelo resíduo na terceira posição. A presença de Hyp favorece o antagonismo (pA2 7.6) no B2A e a actividade agonística parcial no B2B, enquanto que Tyr3 dá um potente agonista no B2A e um antagonista bastante bom (antagonista puro) no B2B. Esta nova classificação foi apresentada em um artigo de revisão (71). Os sites funcionais Kinin são portanto B, e B2 (dois subtipos são contemplados). Vários outros receptores (B3, B4 e B5) foram propostos (72-74), mas sua existência não foi demonstrada com dados experimentais sólidos (ver revisão crítica na Ref. 59). A liberação de histamina induzida pela cinina dos mastócitos peritoneais de ratos é um fenômeno inespecífico que tem sido atribuído ao caráter catiônico das cininas (75, 76).