Partecipanti umani

Gli esperimenti in Spagna sono stati esaminati e approvati dal Comitato Etico dell’Ospedale Universitario La Fe Valencia e aderito ai principi della Dichiarazione di Helsinki e ulteriori revisioni. Gli esperimenti a Berlino sono stati approvati dal comitato etico della Charité-Universitätsmedizin, Berlino (EA4/012/05). Due coorti sono stati studiati: uno consisteva di 65 volontari adulti sani e uno di 16 pazienti con la sindrome di Usher (tipo II) portando diverse mutazioni troncamento in USH2A. I dati di tre pazienti sono stati omessi dal presente studio a causa di due pazienti con una precedente diagnosi di diabete e un paziente con sindrome del tunnel carpale, che potrebbe influenzare le soglie psicofisiche. I partecipanti allo studio sono stati testati con una batteria composta da nove test psicofisici applicati sulla pelle. Tutti i partecipanti hanno ricevuto informazioni scritte e orali prima di prendere parte allo studio e hanno fornito un consenso scritto. Nessuno dei partecipanti allo studio aveva un’età <20 anni. Le seguenti informazioni sui partecipanti sono state documentate: età, sesso, la mano, i dispositivi acustici (apparecchi acustici, impianti cocleari), la gravità dei sintomi di sordità e cecità, e le comorbidità.

I test sensoriali quantitativi umani

I test psicofisici sono stati eseguiti secondo il protocollo standardizzato dei test sensoriali quantitativi del German Research Network on Neuropathic Pain44. Le soglie percettive vibrotattili a diverse frequenze sono state determinate utilizzando un test a due scelte1,2. Il dispositivo era composto da un attuatore piezo lineare (Physik Instrumente, catalogo n. P-602.1 L), i cui spostamenti sono guidati e controllati da un amplificatore / controller (Physik Instrumente, catalogo n. E-665). I segnali sono stati elaborati dal sistema di acquisizione dati PowerLab (PowerLab 4/35, ADInstruments). Lo stimolo di vibrazione era lungo 1,8 s e il tempo di salita e di caduta all’inizio e all’offset erano 500 e 600 ms, rispettivamente, indipendentemente dalla frequenza o dall’ampiezza del test. La durata dello stimolo tra le fasi on- e offset era di 700 ms. Un insieme di stimoli di vibrazione è stato impiegato che scalato logaritmicamente tra 18 nm e 45 μm. Per i test di vibrazione 10-Hz e 125-Hz, l’ampiezza di partenza è stata impostata su 7.18 μm e 2.84 μm, rispettivamente. Non abbiamo misurato direttamente il movimento della sonda nelle condizioni di prova utilizzate. Questo attuatore piezo mostra un’alta fedeltà, ma l’attenuazione dell’ampiezza potrebbe teoricamente verificarsi con spostamenti di ampiezza maggiore vicino all’ampiezza massima della corsa dell’attuatore (35 µm). Tuttavia, tutti i partecipanti hanno mostrato soglie psicofisiche ben al di sotto dei 35 µm per tutte le frequenze testate (Fig. 1c). Si noti che esattamente lo stesso apparecchio è stato utilizzato per la misurazione nei controlli sani e nei partecipanti con la sindrome di Usher. Gli stimoli di vibrazione meccanica sono stati forniti alla pelle tra il letto ungueale e la prima articolazione del mignolo. La sonda era fatta di vetro e aveva un’area di contatto circolare piatta di 5 mm di diametro con un contrappeso di ottone per assicurare che lo stesso grado di forza di tenuta fosse applicato in ogni partecipante. Il mignolo della mano dominante è stato testato su due frequenze (10 Hz e 125 Hz; durata 1.8-s). I partecipanti segnalavano il rilevamento di uno stimolo vibratorio durante una delle due finestre temporali premendo un pulsante. Il protocollo consisteva in un disegno up-down che aumentava o diminuiva l’ampiezza dello stimolo (tra 18 nm e 45 µm), a seconda del tasso di successo durante il compito. Sono state eseguite otto inversioni di ampiezza up-down (un totale di ~40-80 prove individuali per sessione) intorno alla soglia percettiva per creare una soglia percettiva media per ogni paziente. L’ampiezza degli stimoli di vibrazione guidati dal dispositivo piezo è stata calibrata misurando l’ampiezza di spostamento della sonda sotto un microscopio per incrementi di tensione a gradini.

Un test di acuità tattile è stato utilizzato anche per verificare i limiti della risoluzione spaziale del polpastrello (innervazione mediana), utilizzando un test di orientamento tattile a scelta forzata a due intervalli con un cubo di acuità tattile, che consisteva di sei lati con reticoli di diverse larghezze (0,75, 1,25, 1,75, 3,0, 4,5 e 6,0 mm)1,2,3. I partecipanti erano bendati e il cubo veniva posizionato nell’orientamento verticale o orizzontale contro il loro polpastrello. È stata impiegata una procedura two-down e one-up con 10-15 punti di svolta della dimensione della griglia. Le soglie (71% di risposta corretta) sono state calcolate come mediana degli ultimi 10 dei 15 punti di svolta2. Soglie di rilevamento meccanico sono stati determinati utilizzando un set standardizzato di 23 filamenti vFh (Optihair3-Set) con forze tra 0.25 e 265 mN. VFhs sono stati applicati in ordine crescente sulla faccia dorsale della mano (innervazione radiale) per 1 s fino a quando il partecipante ha percepito una sensazione tattile. L’ordine è stato poi invertito fino al punto in cui il partecipante non ha percepito una sensazione tattile. La forza media di cinque inversioni è stata presa come soglia. Le soglie del dolore meccanico sono state testate con una serie di sette stimolatori ponderati (MRC Systems) con punte di 0,25 mm e forze tra 8 e 512 mN. È stato eseguito un semplice metodo a scala (regola dell’uno-su e dell’uno-giù) in cui si chiedeva ai pazienti se lo stimolo era percepito come una nitidezza che causava la sensazione di dolore da puntura. Gli stimoli sono stati applicati all’aspetto dorsale della mano dopo i compiti di rilevamento della vFh. La soglia è stata calcolata dalla media di cinque inversioni. Le soglie di percezione termica calda e fredda, e le soglie del dolore caldo e freddo, sono state testate utilizzando un analizzatore termosensoriale TSA II (MEDOC). Il termodo aveva un’area di 9 cm2, temperature di taglio tra 0 e 50 °C, e un tasso di variazione della temperatura di 1 °C s-1. Il termodo è stato posizionato sull’aspetto volgare della regione medio-avambraccio (innervazione antebrachiale mediale). Sono state eseguite tre prove consecutive per ogni test termico nel seguente ordine: rilevazione del freddo, rilevazione del caldo e soglie del dolore freddo e del dolore caldo. Ai partecipanti allo studio è stato chiesto di indicare a che punto hanno iniziato a sperimentare il raffreddamento, il riscaldamento, il dolore da freddo e da caldo. Le soglie erano la temperatura media delle tre prove di ogni test.

I topi

Tutti gli esperimenti sono stati approvati dal comitato etico per gli animali di Berlino (Landesamt für Gesundheit und Soziales) ed eseguiti in conformità alla legge europea sul benessere degli animali. Maschio e femmina Ush2a-/- topi e compagni di cucciolata wild-type (Ush2a + / +) dallo sfondo CBA / CaJ di età compresa tra 10 e 30 settimane sono stati utilizzati 11. Tutti gli esperimenti anatomici ed elettrofisiologici sono stati eseguiti su un numero approssimativamente uguale di topi femmina o maschio. Per il compito di rilevamento delle vibrazioni solo topi femmina sono stati utilizzati. Tutti i topi sono stati mantenuti su un ciclo di 12 ore di luce: 12 ore di buio.

Tessuto topo anatomia e immunoistochimica

Per immunoistochimica della pelle, i topi sono stati eutanasia da inalazione di CO2 per 2-4 min seguita da dislocazione cervicale, e tessuto cutaneo zampa è stato sezionato e l’ipoderma, legamenti e tessuto muscolare allegato rimosso. I campioni di pelle sono stati allungati con perni di insetti e fissati per 45 minuti in paraformaldeide 4% (PFA). Per le sezioni di gelatina vibratome, i campioni di tessuto sono stati posti in stampi embedding (Polysciences, T-8), riempito con gelatina caldo (20%, sciolto in 0,1 M fosfato-buffered salina (PBS)), e post-fissato in 4% PFA durante la notte a 4 ° C prima di 120-µm sezioni sono state tagliate utilizzando un vibratome (Leica, VT100S). Per la colorazione whole-mount, i campioni di pelle sono stati allungati per 2 ore in PFA, poi post-fissati a 4 ° C per 24 ore in dimetilsolfossido 20% e 80% metanolo. Dopo il taglio o post-fissazione, i campioni di tessuto sono stati lavati tre volte in PBS (0,1 M) e incubati per 72 ore a 4 ° C in soluzione di blocco e anticorpi primari. I campioni sono stati poi lavati tre volte in PBS prima di 24 ore di incubazione (4 ° C) con anticorpi secondari diluiti in soluzione bloccante. Tessuto è stato poi di nuovo lavato tre volte, e trattati per la compensazione del tessuto utilizzando 2,2′ tiodietanolo (TDE, Sigma-Aldrich). Sezioni sono stati posti in concentrazioni crescenti di TDE ogni 2 h, dal 10% al 25%, 50% e 97%, in cui i campioni sono stati conservati e montati su vetrini e copertura scivolato.

Anticorpi policlonali targeting Ush2A sono stati generati nel coniglio da Eurogentec. Sono stati creati quattro anticorpi che si legano a diversi epitopi di legame sul N- e C-termini di Ush2A (N-terminus: anticorpo 1, CSPLYNDKPFRSGDNV e anticorpo 2, C+SWEKPAENFTRGEII; C-terminus: anticorpo 1, C+ADTRLPRSGTPMSIR e anticorpo 2, CIRERPPLVPLQKRMT), e sono stati purificati da antisera prima dell’uso. Tutti e quattro gli anticorpi sono stati utilizzati insieme (1:200) per i protocolli di colorazione in colorazioni sequenziali con pollo anti-NF200 (Millipore, 1:1.000), coniglio anti-S100 (Dako, 1:1.000) o cavia anti-CK20 (Origene Tech, 1:200). Anticorpi secondari utilizzati erano anti-rabbit Alexa Fluor 488 (Invitrogen, 1:800), anti-pollo Alexa Fluor 647 (Invitrogen 1:800), anti-mouse Alexa Fluor 633 (Invitrogen, 1:800), anti-rabbit Alexa Fluor 647 (Invitrogen 1:800) e anti-porcellino d’India Alexa Fluor 647 (Invitrogen, 1:800). Tiled z-stack immagini sono state ottenute utilizzando un microscopio confocale (Carl-Zeiss, catalogo n. LSM700) utilizzando Zen2009 software. NF200 + e S100 + fibra nervosa-innervando corpuscoli di Meissner e follicoli piliferi sono stati visualizzati e contati utilizzando Fiji/ImageJ. Per le immagini al microscopio elettronico del nervo sciatico, gli animali sono stati perfusi e il nervo sciatico è stato sezionato e fissato in 4% PFA e 2,5% glutaraldeide, e contrastato con tetrossido di osmio prima di embedding in resina Technovit 7100 (Heraeus Kulzer). Sezioni ultrasottili sono stati catturati a 5.600 × ingrandimento. Fibre nervose mielinizzate e non mielinizzate sono state contate e misurate utilizzando il software Fiji/ImageJ.

Riproducibilità

Tutti gli esperimenti immunoistochimici e le immagini catturate sono stati ripetuti in più coorti di topi in giorni diversi, e nessuna immagine è stata presa da singoli individui che non potevano essere riprodotti. Le immagini di microscopia elettronica sono state prese da diversi compagni di cucciolata in una singola esecuzione sperimentale.

Preparazione dei nervi cutanei dei topi e registrazioni afferenti sensoriali

Le registrazioni delle fibre sensoriali cutanee sono state effettuate utilizzando la preparazione dei nervi cutanei ex vivo. I topi sono stati eutanasia per inalazione di CO2 per 2-4 min seguita da dislocazione cervicale. Tre diverse preparazioni sono state eseguite in esperimenti separati utilizzando diverse regioni zampa: il nervo safeno innervare la pelle pelosa zampa posteriore 21; il nervo tibiale innervare la pelle glabra zampa posteriore, e il nervi mediale e ulnare innervare la pelle glabra zampa anteriore 20. In tutte le preparazioni, la pelle pelosa dell’arto è stato rasato e la pelle e il nervo sono stati sezionati libero e trasferito alla camera di registrazione, dove i tessuti muscolari, ossei e tendini sono stati rimossi dalla pelle per migliorare la qualità della registrazione. La camera di registrazione è stato perfuso con un fluido interstiziale 32 ° C sintetico: 123 mM NaCl, 3.5 mM KCl, 0.7 mM MgSO4, 1.7 mM NaH2PO4, 2.0 mM CaCl2, 9.5 mM gluconato di sodio, 5.5 mM glucosio, 7.5 mM saccarosio e 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine-etanesulfonic acid (Hepes), pH 7.4. La pelle è stata appuntata e allungata, in modo che la parte esterna della pelle potesse essere stimolata con sonde stimolatrici. Il nervo periferico è stato alimentato attraverso una camera adiacente in olio minerale, dove filamenti sottili sono stati stuzzicati dal nervo e posto su un filo d’argento elettrodo di registrazione.

I campi recettivi dei meccanorecettori individuali sono stati identificati sondando meccanicamente la superficie della pelle con una bacchetta di vetro smussato o pinze smussate. Uscita analogica da un amplificatore Neurolog è stato filtrato e digitalizzato utilizzando il sistema Powerlab 4/30 e software Labchart 7.1 (ADinstruments). Spike-estensione istogramma per Labchart 7.1 è stato utilizzato per ordinare picchi di singole unità. Stimoli elettrici (1 Hz, impulsi quadrati di 50-500 ms) sono stati consegnati ai campi recettivi delle singole unità per misurare la velocità di conduzione e consentire la classificazione come fibre C (velocità <1.2 m s-1), Aδ-fibre (1.2-10 m s-1) o Aβ-fibre (>10 m s-1). La stimolazione meccanica dei campi recettivi dei neuroni sono stati eseguiti utilizzando un attuatore piezoelettrico (Physik Instrumente, catalogo n. P-841.60) e una doppia estremità Nanomotor (Kleindiek Nanotechnik, catalogo n. MM-NM3108) collegato ad un dispositivo di misurazione della forza (Kleindiek Nanotechnik, catalogo n. PL-FMS-LS). Misurazioni di forza calibrate sono state acquisite simultaneamente utilizzando il sistema Powerlab e il software Labchart durante l’esperimento (dati estesi Fig. 10).

Come diversi tipi di fibre hanno diverse proprietà di stimolo-tuning, diversi protocolli di stimoli meccanici sono stati utilizzati in base al tipo di unità. Bassa soglia Aβ-fibre (RAMs e SAMs) e Aδ-fibra D-capelli sono stati stimolati con l’attuatore piezo con tre stimoli di vibrazione (5 Hz, 25 Hz e 50 Hz, distorsioni introdotte dal sensore di forza in serie precluso utilizzando frequenze >50 Hz) con ampiezza crescente su sei passi (picco-picco ampiezze di ~ 6-65 mN; 20 cicli per passo), e una sequenza di stimoli dinamici con quattro forme d’onda ramp-and-hold con diverse velocità di deflessione della sonda (durata 3 s; 0.075, 0.15, 0.45 e 1.5 mm s-1; ampiezza media 100 mN). Aβ-fibre SAMs e RAMs sono stati classificati dalla presenza o assenza di cottura durante la fase statica di una rampa e tenere stimolo, rispettivamente, come precedentemente descritto 20,21. Singole unità sono stati inoltre stimolati con una serie di cinque stimoli meccanici statici con rampa-e-tenuta forme d’onda di ampiezza crescente (3 s durata; che vanno da ~ 10 mN a 260 mN). SAMs bassa soglia, ad alta soglia Aδ-fibre e C-fibre sono stati stimolati anche utilizzando il nanomotore con cinque ramp-and-hold stimoli con ampiezze crescenti20.

registrazioni di singole unità da afferenze Pacinian

Per valutare la meccanosensibilità dei corpuscoli Pacinian situato intorno alla fibula, la pelle e tutti i muscoli sono stati rimossi dalla gamba inferiore e il nervo interosseo è stato sezionato libero dalla membrana interossea. Successivamente, il perone e la tibia, che nei topi sono fusi lungo la loro metà distale, sono stati rimossi dall’animale, insieme al nervo interosseo, e sono stati trasferiti in una camera da bagno d’organo personalizzata dove sono stati montati utilizzando una mini-mice personalizzata. L’intera procedura di dissezione è stata eseguita in ghiaccio buffer dissezione freddo che conteneva 108 mM N-metil-d-glucamina, 20 mM Hepes, 3,5 mM KCl, 10 mM MgSO4, 26 mM NaHCO3, 1,7 mM NaH2PO4, 9,5 mM gluconato di sodio, 5,5 mM glucosio, 18,5 mM saccarosio e 0,5 mM CaCl2 (regolata a pH 7,4 con NaOH). Dopo un periodo di recupero di 10 min, la preparazione è stata perfusa con tampone di registrazione ossigenato (35 ° C), che consisteva di 108 mM NaCl, 3,5 mM KCl, 0.7 mM MgSO4, 26 mM NaHCO3, 1.7 mM NaH2PO4, 9.5 mM gluconato di sodio, 5.5 mM glucosio, 7.5 mM saccarosio e 1.5 mM CaCl2 (regolata a pH 7.4 con NaOH), e l’estremità prossimale del nervo interosseo è stato trasferito in una camera di registrazione riempita di olio infilandolo attraverso un piccolo foro (~ 1 mm di diametro) che collegava la camera bagno organo con la camera di registrazione adiacente. Dopo la rimozione del perinevrio, singoli filamenti sono stati sezionati libero e attaccato all’elettrodo di registrazione per la registrazione del potenziale d’azione. Le registrazioni sono state effettuate con il sistema Neurolog (Digitimer Ltd, catalogo n. NL100AK e NL104A) e un PowerLab 4SP controllato da LabChart 7.1 (AD Instruments). Per determinare la soglia di attivazione meccanica e la sintonizzazione della frequenza delle afferenze paciniane, una serie di stimoli meccanici sinusoidali (durata 1 s; ampiezza linearmente crescente damp/dt = 30 µm s-1; ampiezza massima 30 µm) con frequenze crescenti (40-480 Hz) è stata applicata all’estremità distale del perone con un’asta metallica (diametro della punta 1 mm) collegata ad un attuatore piezoelettrico (Physik Instrumente GmbH, catalogo no. P-840.2).

Compito di apprendimento della percezione delle vibrazioni nel topo

Prima di tutto, per l’impianto del poggiatesta, i topi sono stati anestetizzati con isoflurano (1,5-2% in O2) e iniettati sottocutaneamente con metamizol (200 mg per kg di peso corporeo). Un supporto metallico leggero è stato impiantato sul cranio con colla (UHU dent) e cemento dentale (Paladur). La temperatura dei topi è stata monitorata con una sonda rettale e mantenuta a 37 °C con un cuscinetto riscaldante. I topi sono stati poi collocati nella loro gabbia con metamizolo (200 mg ml-1) nell’acqua da bere. I topi impiantati sono stati abituati al contenimento della testa 3-5 d dopo l’intervento. I topi sono stati gradualmente abituati nel setup comportamentale alla fissazione della testa. Successivamente, 1 d dopo l’inizio della restrizione idrica, i topi sono stati sottoposti a due sessioni di accoppiamento in giorni consecutivi.

Durante le sessioni di accoppiamento (30- a 45-min durata), premi d’acqua sono stati dati da un beccuccio acqua accoppiato con presentazione dello stimolo di vibrazione (3 s durata, 5 Hz, 60 mN) alla pelle glabra della zampa anteriore per costruire un’associazione tra stimolo e ricompensa. Lo stimolo di vibrazione è stato dato alla zampa tramite una bacchetta di vetro ammortizzata personalizzata di 2 mm2 collegata a un attuatore piezoelettrico (PICMA di Physik Instrumente, numero di catalogo PL127.11). Un rapporto tensione-forza è stato calibrato utilizzando un sistema di misurazione della forza (Dual-Mode Lever Arm system 300-C, Aurora Scientific) per misurare il profilo di forza sinusoidale applicata dal dispositivo piezo dopo ogni esperimento. L’attuatore piezo di piegatura utilizzato potrebbe aver aggiunto un po’ di rumore armonico rispetto ad altri sistemi piezo impilati. Tuttavia, la calibrazione del piezo in ogni esperimento ha assicurato che i deficit sostanziali nella percezione tattile dei topi Ush2a-deficienti era improbabile che fosse un artefatto tecnico.

Dopo l’accoppiamento, sessioni giornaliere di formazione iniziato durante il quale i topi ricevuto una piccola ricompensa acqua (4-7 μl) dal becco quando hanno leccato correttamente durante una finestra di opportunità all’inizio dello stimolo (3.5 s). Le prove di cattura, dove non è stato presentato alcuno stimolo e le leccate sono state contate come falsi allarmi, sono state intervallate come il 50% delle prove totali. Prove non sono stati indicati da qualsiasi evento esterno o stimolo come precedentemente descritto 10 e sono stati consegnati a intervalli di tempo randomizzati tra 3 e 30 s. Se i topi leccato durante una finestra 2-s prima dell’inizio stimolo, un 3- a 30-s ritardo è stato imposto per promuovere stimolo-acqua associazione ricompensa. Una sessione di formazione consisteva di circa 60 prove (30 × stimolo + 30 × cattura). Colpi e tassi di falso allarme sono stati confrontati per valutare le prestazioni durante le sessioni di formazione. Per verificare che i topi erano leccare in risposta allo stimolo di vibrazione della zampa anteriore, una sessione è stata inclusa alla fine della formazione in cui il dispositivo di stimolazione è stato spostato 3-5 mm sotto la zampa, in modo che nessun contatto con la pelle è stata fatta. Nei giorni sperimentali successivi, dopo che i topi avevano imparato con successo il compito, gli stimoli di vibrazione sono stati dati con diverse ampiezze e frequenze. Per la vibrazione a 5 Hz, forze di 48 mN, 36 mN, 24 mN, 12 mN e 6 mN sono state utilizzate per stimolare la zampa anteriore, con due diverse ampiezze intervallate da prove di cattura durante ogni giorno. Per esempio, gli stimoli 48-mN e 24-mN e le prove di cattura sono stati intervallati durante una sessione, che consisteva di circa 100 prove (33× stimolo 48-mN + 33× stimolo 24-mN + 34× cattura). Gli stimoli 6-mN sono stati testati in due sessioni. Per 25-Hz e 125-Hz vibrazione, 60-mN e 12-mN forze della stessa frequenza sono stati intervallati con prove di cattura nello stesso modo su due sessioni di test.

Mouse paired-pulse inibizione comportamentale

La risposta startle dei topi è stata valutata utilizzando il sistema Startle Response (SR-LAB, San Diego Instruments). I topi sono stati abituati all’apparato per 30 min ogni giorno per 3 d prima del test. In breve, le risposte startle del topo sono state misurate su un totale di 48 prove di impulso-alone45 (40 ms di durata, 129 dB) e prepulse + prove di impulso (20 ms prepulse di 69, 73 o 81 dB). Le prove di preimpulso erano 200 ms prima delle prove di impulso. La percentuale di inibizione dell’impulso accoppiato (% PPI) per ogni intensità di preimpulso è stata calcolata come %PPI = 100 × ((impulso da solo) – (preimpulso + impulso))/impulso da solo.

Topo vFh e saggi comportamentali a spazzola

I topi sono stati abituati all’ambiente di prova per 30 min ogni giorno per 3 d prima della prova. Nei giorni di sperimentazione, i topi sono stati collocati in cubicoli individuali di plexiglas su una piattaforma di rete elevata. Per il test del pennello, la zampa posteriore sinistra è stato accarezzato dal tallone alla punta con un 2 millimetri testa pennello 10 × a intervalli casuali. La percentuale di prelievi è stata calcolata. Nei giorni successivi, le soglie di ritiro meccanico nocifensivo sono stati misurati utilizzando vFhs. Brevemente, le superfici plantari della zampa posteriore sinistra sono stati stimolati con filamenti vFh e la soglia riflessa è stata determinata utilizzando il metodo up-down46. A seconda della risposta dell’animale, maggiore o minore forza vFhs sono stati applicati alla zampa posteriore per stabilire una serie di sei a nove ritiri riflessi positivi o negativi. Questo modello di risposte è stato poi convertito in modo che i dati sono espressi come il log della media della soglia di ritiro riflesso del 50%46.

Analisi dei dati psicofisici umani

I dati sono stati testati per la normalità, e le differenze nelle prestazioni psicofisiche per ogni test tra i partecipanti di controllo e pazienti con sindrome di Usher sono stati confrontati utilizzando t-test di Student non abbinati o Mann-Whitney U-test. Le z-trasformazioni sono state utilizzate per confrontare i singoli profili di dati individuali con la media e la s.d. del controllo sano. Lo z-score è stato calcolato utilizzando fogli di calcolo Excel sulla base della formula z = (punteggio del paziente – media del gruppo per s.d. della media del gruppo). I valori z >0 indicano un guadagno di funzione, il che significa che il partecipante è più sensibile agli stimoli testati rispetto ai controlli sani. I singoli z-scores che si trovano al di fuori dell’intervallo di confidenza del 95% (cioè, z-score <1,96 o >1,96 s.d.) del dataset di controllo sano possono essere identificati. La performance in ogni test è stata testata nei confronti a coppie usando il test U di Mann-Whitney e abbiamo considerato P < 0,01 come statisticamente significativo.

Analisi dei dati del comportamento di vibrazione del topo

I colpi sono stati registrati con un sensore sulla punta del beccuccio dell’acqua di ricompensa. Nelle prove di stimolo, un colpo è stato contato quando c’era una leccata entro la finestra di opportunità (3,5 s) dopo l’inizio dello stimolo. I dati comportamentali sono stati raccolti utilizzando routine personalizzate in Lab View ad una frequenza di campionamento 1-kHz, e script Python personalizzati sono stati utilizzati per l’analisi. Durante le prove di cattura, un falso allarme ha avuto luogo quando c’era una leccata durante una finestra di opportunità altrettanto lunga. Per valutare se i topi hanno imparato con successo il compito di rilevamento, i tassi di successo sono stati confrontati con i tassi di falso allarme all’interno della stessa sessione di formazione, utilizzando due vie ripetute misure analisi della varianza (ANOVA) con test post-hoc di Bonferroni.

Per quantificare le prestazioni nei compiti di rilevamento, abbiamo usato d’ (indice di sensibilità) invece della percentuale di prove corrette per tener conto di bias nei criteri di leccamento47. Per calcolare d’, è stata utilizzata la seguente formula: d’ = z(h) – z(fa), dove z(h) e z(fa) sono l’inverso normale della funzione di distribuzione cumulativa dei tassi di successo e falso allarme, rispettivamente. Per evitare valori infiniti d’, quando tutte le prove sono stati segnalati (tasso = 1) o nessuno era (tasso = 0), i tassi sono stati sostituiti da (1½N) o (½ N), rispettivamente, dove N è il numero di prove in cui lo stimolo è stato presentato48. I punteggi z per i tassi di hit e falso allarme sono stati calcolati utilizzando OpenOffice Calc (Apache Software Foundation) con la funzione NORMINV. Abbiamo eseguito test statistici su dati solo dove almeno uno dei genotipi mostra d’ > 1.0, indicando che questi topi segnalato lo stimolo. I dati comportamentali sono stati raccolti utilizzando routine personalizzate in Lab View ad una frequenza di campionamento 1-kHz, e script Python personalizzati sono stati utilizzati per l’analisi. I codici e gli script personalizzati sono disponibili su richiesta; maggiori informazioni sono disponibili nel Nature Research Reporting Summary associato a questo manoscritto.

I comportamenti di leccata sono stati calcolati e tracciati come probabilità di leccata, frequenza di prima leccata (Hz) o latenza media prima leccata (s). Queste misure sono state calcolate come segue: la probabilità di leccare è la probabilità che un topo lecchi almeno una volta durante la finestra di opportunità in una prova di stimolo o di cattura (prove con almeno 1 lecca / totale delle prove). Nel PSTHs di prime leccate mostriamo la distribuzione in binned delle latenze di prime leccate in stimolo o prove di cattura. Per normalizzare questi dati tra i topi, abbiamo diviso il numero di prime leccate per il numero totale di prove. Dividendo il valore della prima leccata per la larghezza del bin, abbiamo calcolato il valore in hertz (leccate per s). La latenza media della prima leccata (s) è stata calcolata sommando le latenze della prima leccata in ogni prova e dividendo per il numero totale di prove.

Analisi dei dati delle registrazioni della preparazione dei nervi cutanei

Le unità cutanee della zampa anteriore e posteriore sono state classificate in base alla loro velocità di conduzione e alle risposte agli stimoli meccanici. Le soglie meccaniche delle unità sono state calcolate come la temperatura o l’ampiezza meccanica necessaria per suscitare il primo potenziale d’azione. Tutte le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando GraphPad Prism 6.0 e Python. I test statistici includono ANOVA a due vie a misure ripetute con test post-hoc di Bonferroni, test t di Student, test U di Mann-Whitney e test a coppie abbinate di Wilcoxon. I test Kolmogorov-Smirnov sono stati utilizzati per valutare la normalità dei dati. Gli asterischi nelle figure indicano la significatività statistica: *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.

Analisi dei dati della microscopia elettronica del nervo del topo

Per l’analisi delle micrografie elettroniche del nervo sciatico del topo, il numero di fibre mielinizzate e non mielinizzate è stato contato in 12 sezioni per nervo. Il numero totale di fibre per nervo è stato poi estrapolato dall’area della sezione trasversale di ogni nervo.

Reporting summary

Ulteriori informazioni sul disegno della ricerca sono disponibili nel Nature Research Reporting Summary collegato a questo articolo.