La leishmaniosi canina (CanL) è un’infezione/malattia protozoaria causata da Leishmania infantum (sinonimi: Leishmania chagasi; Leishmania infantum chagasi) molto diffusa in tutti i paesi delle regioni mediterranee, caucasiche e mediorientali del Vecchio Mondo, così come in diversi territori dell’America Latina (Dantas-Torres et al., 2012). Gli esiti dell’infezione nei cani vanno dal subclinico al clinico, e dalla malattia lieve a quella grave. Sebbene il parassita possa occasionalmente essere trasmesso con modalità non vettoriali (EFSA Panel on Animal Health and Welfare, 2015), la principale via di trasmissione è la puntura di mosche della sabbia flebotomine infette. Da circa 7 giorni dopo un pasto di sangue infetto, i vettori competenti possono sviluppare Leishmania promastigoti infettivi nell’intestino anteriore, che vengono rigurgitati nella pelle del mammifero ospite durante il successivo pasto di sangue (Bates, 2007). Sia i cani subclinici che quelli malati possono essere infettivi per i vettori; tuttavia, la probabilità di contribuire in modo sproporzionato alla trasmissione successiva (effetto “super-spreader”) aumenta con la durata e la gravità della CanL (Courtenay et al., 2014).

Phlebotomus perniciosus è il principale vettore competente di L. infantum in tutto il bacino del Mediterraneo occidentale, compresa l’Europa meridionale e l’Africa nord-occidentale (European Centre for Disease Prevention and Control, 2019). Inoltre, P. perniciosus è un membro rappresentativo di un gruppo tassonomico più ampio, il sottogenere Larroussius, composto da specie morfologicamente, geneticamente e biologicamente vicine che agiscono come vettori competenti di L. infantum nel Mediterraneo centrale e orientale, come Phlebotomus neglectus e Phlebotomus tobbi (Alten et al., 2016). L’uso di piretroidi topici è universalmente considerato l’approccio di prima linea per proteggere i cani sani dalle punture di mosca della sabbia infetta da Leishmania (Maroli et al., 2010), mentre la gestione dei cani infetti/infettivi è un compito complesso a causa della mancanza di un ampio consenso sull’approccio da adottare. Idealmente, le cure veterinarie individuali per la gestione della patologia della CanL dovrebbero essere combinate con misure che mirano a prevenire la diffusione del parassita attraverso il vettore. Quest’ultimo è particolarmente importante come parte dei programmi di controllo della VL zoonotica attualmente intrapresi in diversi paesi endemici. Da un lato, i proprietari sono riluttanti a investire in prodotti piretroidi per cani già infetti o malati; dall’altro, le terapie antileishmaniane hanno solo un’efficacia temporanea per ridurre in modo consistente l’infettività del cane nei confronti delle mosche della sabbia (Miró et al., 2017). Le isossazoline sono una nuova classe di composti che prendono di mira il sistema nervoso centrale e le giunzioni neuromuscolari degli artropodi vettori bloccando i canali del cloruro legati al ligando, causando così la morte dell’artropode (Weber & Selzer, 2016). Un certo numero di composti sono stati autorizzati come farmaci veterinari per la protezione degli animali da compagnia contro pulci e zecche, con lunghe emivite in vivo che forniscono settimane o mesi di protezione dopo una singola somministrazione orale (Kilp et al., 2014; Shoop et al., 2014). Queste proprietà hanno attirato l’attenzione per il potenziale utilizzo delle isossazoline per il controllo delle malattie umane trasmesse da vettori (Miglianico et al., 2018). Per quanto riguarda gli insetti volanti, sia il grado che la durata dell’efficacia insetticida sono risultati diversi tra i farmaci isossazoline disponibili in commercio quando somministrati nei cani, come contro Triatoma infestans (Loza et al., 2017) o la mosca della sabbia Phlebotomus papatasi (Gomez et al., 2018a), con il fluralaner (Bravecto®; Merck Animal Health) dimostrato essere il composto più attivo per quanto riguarda i suddetti parametri di efficacia. Recentemente, uno studio clinico sul trattamento con fluralaner dei cani contro le mosche della sabbia ha fatto uso di P. papatasi colonizzata come specie bersaglio (Gomez et al., 2018b). Tuttavia, questa specie può non essere considerata un modello di mosca della sabbia adatto. Questo principalmente perché P. papatasi non è un vettore competente di L. infantum, essendo refrattario allo sviluppo intestinale di questo parassita. Inoltre, studi precedenti sui piretroidi topici canini (Maroli et al., 2010) suggeriscono che P. papatasi potrebbe essere meno suscettibile ai composti che colpiscono il sistema nervoso centrale della mosca della sabbia rispetto a P. perniciosus. Per esempio, una formulazione spot-on del 50% di permetrina-10% di imidacloprid ha ucciso il 29% di P. papatasi contro il 49% di P. perniciosus. Queste considerazioni ci hanno spinto a determinare l’insorgenza e la durata dell’efficacia insetticida contro P. perniciosus dopo l’alimentazione di cani trattati con fluralaner.

E’ stato eseguito uno studio di efficacia a gruppi paralleli, a controllo negativo, randomizzato, in cieco, monocentrico. I cani sperimentali, costituiti da Beagle maschi di età ≥ 6 mesi al momento dell’inclusione, provenivano da una colonia di ricerca di Mohammedia, in Marocco; lo studio della fase in-life è stato condotto presso le strutture della Clinvet. Gli esemplari adulti di P. perniciosus provenivano da un ceppo spagnolo mantenuto da giugno 2012 in poi presso le strutture di entomologia medica dell’Istituto Superiore di Sanità, Italia, a 28 ± 1 °C e 75-80% di umidità relativa. Le mosche della sabbia sono state certificate come esenti da patogeni e adattate a condizioni di allevamento di massa con sei sottolinee di colonie indipendenti. Gli esemplari da tre a nove giorni di età sono stati raggruppati dalle rispettive gabbie emergenti e distribuiti in proporzioni di età simili in vasi di plastica cilindrici (400 mL) dotati di un coperchio stretto, che è stato perforato e il foro coperto con una garza fine con un pezzo di cotone imbevuto di soluzione satura di glucosio. Il numero di mosche della sabbia in ogni vaso era sufficiente per un cane, con l’aggiunta di alcuni esemplari extra per compensare le morti avvenute prima degli esperimenti. I vasi sono stati messi in sacchetti di plastica ermetici dotati di carta da filtro umidificata. L’imballaggio secondario consisteva in un contenitore preriscaldato dotato di un dispositivo di stabilità della temperatura estesa e di un registratore di temperatura digitale, circondato da una robusta scatola di cartone. Le scatole sono state spedite in Marocco per via aerea e la consegna è avvenuta approssimativamente entro 3 giorni dalla spedizione. Alla consegna, la registrazione della temperatura è stata controllata e i sacchetti di plastica sono stati lasciati aperti a 25 ± 3 °C in attesa dell’esposizione dei cani. Una valutazione approssimativa della mortalità della mosca della sabbia nei vasi è stata eseguita dall’esterno, e un tasso di mortalità di ≤ 10% per vaso è stato considerato accettabile per l’uso. In definitiva, al momento degli esperimenti, ogni cane è stato esposto alla stessa popolazione omogenea di mosche della sabbia di 7-14 giorni.

Ventisette giorni prima del trattamento, 14 cani Beagle maschi sono stati sedati con Domitor® (Vetoquinol, Lure, Francia) e la loro testa è stata esposta per 1 ora ai morsi di circa 40 femmine di P. perniciosus in gabbia, insieme a cinque maschi per promuovere il comportamento mordace, allo scopo di valutare l’attrattiva individuale per il vettore in queste condizioni sperimentali. I cani sono stati classificati in ordine decrescente in base al conteggio dei campioni di sangue vivo; due cani con il conteggio più basso sono stati esclusi dallo studio, e dodici cani sono stati inclusi e assegnati a due gruppi di sei cani ciascuno (Gruppi 1 e 2). Il giorno 0, i cani del Gruppo 2 sono stati trattati con una dose orale di fluralaner (Bravecto® compresse masticabili) a un dosaggio di etichetta da 25 a 56 mg/kg di peso corporeo, mentre i cani del Gruppo 1 non sono stati trattati. Osservazioni specifiche sulla salute sono state effettuate a 1, 2 e 6 ore dopo la somministrazione del fluralaner all’ultimo cane. L’esposizione dei cani a circa 40-60 femmine di P. perniciosus (più 5-10 maschi) è stata eseguita in parallelo per entrambi i gruppi, in condizioni di temperatura e umidità simili in due stanze, nei giorni 1, 28 e 84 (inizialmente era stata considerata una valutazione intermedia per il periodo a circa 50-60 giorni dopo il trattamento, ma ciò non è stato possibile per questioni tecniche e logistiche). Il criterio primario per la determinazione dell’efficacia è stato il tasso di sopravvivenza delle mosche della sabbia completamente nutrite sui cani trattati rispetto a quelle completamente nutrite sui cani di controllo, mentre gli esemplari parzialmente o marginalmente nutriti non sono stati considerati. Per consentire un confronto ottimale e duraturo tra i due gruppi di esemplari di mosca della sabbia, le femmine sono state raccolte individualmente dalle gabbie di esposizione attraverso una delicata aspirazione della bocca, e riunite in gruppi di ≤ 10 esemplari all’interno di vasi di plastica rivestiti di gesso. I vasi sono stati poi collocati in scatole fornite di glucosio saturo e carta da filtro umidificata, e mantenuti successivamente a 26 °C. Le valutazioni di vitalità sono state condotte a 6 ore (tranne il giorno 1), e poi a intervalli di 24 ore fino a un massimo di 96 ore dopo la fine dell’esposizione. Per valutare la vitalità generale del lotto di sand-fly impiegato in ogni esperimento, le procedure sopra descritte sono state applicate sia alle femmine nutrite che a quelle non nutrite.

La significatività statistica dei risultati dell’efficacia insetticida, espressa come proporzione di conteggi di mosche della sabbia alimentate vive del gruppo 2 rispetto a quelle del gruppo 1, è stata calcolata utilizzando un modello misto lineare che include il gruppo di studio come effetto fisso e un blocco di randomizzazione come effetto casuale, con il livello di significatività impostato su α = 0,05 (a due facce). Il modello ha utilizzato la regolazione Kenward-Rogers per determinare i gradi di libertà del denominatore.

Il giorno 1, sono stati valutati 78 campioni nutriti con sangue su un totale di 159 femmine vive raccolte dal gruppo 2 contro 64 campioni nutriti con sangue/169 femmine vive del gruppo 1. Il giorno 28, i campioni nutriti con sangue erano 199/341 femmine vive del gruppo 2, che sono state valutate contro 146/310 del gruppo 1. Il giorno 84, i campioni nutriti con sangue erano 240/326 del gruppo 2 e 206/339 del gruppo 1, rispettivamente. La tabella 1 mostra le proporzioni medie di P. perniciosus sopravvissuti dopo aver assunto un pasto di sangue su cani trattati e non trattati. Il giorno 1 dal trattamento, c’era evidenza di alcuni decessi tra le mosche della sabbia ingorgate già al momento della raccolta dalle gabbie di esposizione del Gruppo 2, anche se nessuno da quelle del Gruppo 1. Entro 24 ore, tutti gli esemplari nutriti con sangue del Gruppo 2 erano morti in contrasto con l’11% degli esemplari nutriti con sangue del Gruppo 1. Il giorno 28, la sopravvivenza degli esemplari nutriti con cani del Gruppo 2 era significativamente inferiore a quella degli esemplari del Gruppo 1 già a 6 ore dal pasto di sangue; ancora una volta, tutti gli esemplari nutriti con sangue del Gruppo 2 erano morti a 24 ore, in contrasto con il 3% degli esemplari nutriti con sangue del Gruppo 1. Il giorno 84, un certo numero di esemplari che si erano nutriti di cani trattati sono sopravvissuti fino alla fine delle osservazioni, con ampie variazioni all’interno del gruppo; il loro tasso di sopravvivenza è diminuito a partire dalle 24 h ed è stato significativamente inferiore a partire dalle 48 h rispetto agli esemplari nutriti con cani di controllo, con un’attività insetticida calcolata superiore al 50% fino alle 96 h di osservazione.

Sono stati valutati anche i tassi di sopravvivenza delle mosche della sabbia non nutrite raccolte dalle gabbie di esposizione fino a 96 ore dopo l’esposizione di ogni cane. Erano generalmente elevati e più alti rispetto a quelli degli esemplari nutriti con sangue, mostrando alcune differenze tra ogni giorno di esposizione di un cane, anche se non così tanto tra i gruppi sperimentali in ogni esposizione. Questo può riflettere le variazioni da lotto a lotto nella mortalità che si verificano tipicamente tra le generazioni di mosche della sabbia colonizzate, e forse diverse condizioni di trasporto. L’ingestione di sangue è stata l’unica variabile associata al 100% di mortalità della mosca della sabbia nei cani trattati con fluralaner (Fig. 1).

Il presente studio, pur non confrontando diverse specie di mosca della sabbia, fornisce ulteriori prove che la suscettibilità ai prodotti insetticidi canini che colpiscono il sistema nervoso centrale della mosca della sabbia, può essere maggiore in P. perniciosus che in P. papatasi. Utilizzando la stessa formulazione e le stesse dosi di fluralaner in uno studio che includeva i Beagle esposti a questa specie, Gomez et al. (2018b) hanno registrato una parziale sopravvivenza delle femmine di P. papatasi nutrite a sangue (nell’ordine del 6-7%) già a 17-31 giorni dopo il trattamento, che è aumentata a circa il 25% al giorno 45.

C’è >un periodo di ritardo di 5 giorni perché una mosca della sabbia sia infettiva dopo aver ingerito un pasto di sangue infetto. Pertanto, c’è una sfida tecnica per gli studi con insetticidi sistemici nelle mosche della sabbia per quanto riguarda il mantenimento di una sopravvivenza elevata e duratura degli esemplari di controllo alimentati a sangue e la rilevazione di eventuali effetti insetticidi ritardati che hanno ancora un potenziale di trasmissione-blocco. Questa sfida è diversa dagli studi più comuni con trattamenti anti-alimentazione, dove le mosche della sabbia vengono uccise dagli operatori immediatamente dopo l’esposizione del cane e valutate come alimentate/senza sangue. Sono necessarie valutazioni a lungo termine per garantire l’interpretazione significativa e la significatività statistica delle differenze di sopravvivenza tra i gruppi trattati e quelli di controllo (ad esempio durante le concentrazioni in fase discendente dei farmaci nel plasma canino). L’uso di sangue canino ex vivo da entrambi i cani trattati e di controllo nei sistemi di alimentazione artificiale può essere soggetto a contaminazione batterica e quindi causare la rapida morte di qualsiasi mosca della sabbia ingorgata, permettendo così solo una finestra temporale ristretta per discriminare tra farmaci attivi e non attivi (Gomez et al., 2018a). Nel presente studio, il tasso di sopravvivenza degli esemplari di controllo alimentati a sangue è stato molto soddisfacente, con un intervallo di 61-81% a 96 h post pasto di sangue.

La farmacocinetica del fluralaner nel plasma canino dopo una singola somministrazione orale ha mostrato un andamento discendente regolare fino a circa 100 giorni dopo il trattamento, quando diventa non rilevabile (Kilp et al., 2014). È interessante notare che un intervallo medio teorico di circa 40-100 ng di fluralaner/mL di plasma, corrispondente a 84 giorni dopo il trattamento, era ancora in grado di uccidere > il 50% di P. perniciosus entro 48 h dopo un pasto di sangue. Pertanto, le concentrazioni plasmatiche intermedie, come quelle previste tra 28 e 84 giorni dal trattamento, sono anche in grado di fornire un’elevata attività insetticida contro il vettore, e quindi sono necessari nuovi studi per confermare questo. D’altra parte, i risultati del presente studio rispetto ai tre punti temporali mostrano chiaramente una tendenza coerente di riduzione dell’efficacia durante tutto lo studio.

In conclusione, il trattamento con fluralaner dei cani rappresenta un metodo promettente per ridurre il pool di vettori infetti in contesti endemici di VL zoonotica. Inoltre, l’uso del fluralaner in combinazione con trattamenti topici preventivi con piretroidi, a condizione che questo non sia controindicato per la sicurezza del cane (Walther et al., 2014), potrebbe fornire benefici per i cani in aree ad alto rischio.