February 15, 2010 (Vol. 30, No. 4)

Scott B. Mohler

Passi semplici per il successo della bioluminescenza negli animali

La luciferina è il substrato di base dei saggi bioluminescenti. Basata su una semplice reazione in cui l’ATP alimenta la luciferasi catalitica della lucciola (coleottero) luciferina per produrre luce, la bioluminescenza ha ampie applicazioni. Il suo impiego come indicatore di biomassa permette il rilevamento di microrganismi in prodotti di consumo, superfici di impianti di produzione, ed è stato anche usato per determinare se la vita esiste sulla luna e su Marte.

La bioluminescenza viene usata nel monitoraggio in vitro e in vivo dei processi biologici, compresa l’espressione genica e le interazioni proteina-proteina. La luciferina è usata, per esempio, nei saggi dei geni reporter per studiare la regolazione e la funzione dei geni, dove l’espressione del reporter legato alla luciferina è un marcatore per indicare il successo dell’assorbimento del gene di interesse nelle tecniche del DNA ricombinante. Come reagente di rilevamento, la reazione luciferina-luciferasi è utilizzata nel pirosequencing per realizzare il rilevamento rapido delle basi negli attuali sistemi di sequenziamento del DNA ad alta produttività.

Più recentemente, l’imaging con bioluminescenza è emerso come una tecnica potente per lo studio diretto di diverse popolazioni di cellule in piccoli animali vivi come i topi. In questa tecnica, le cellule (ad esempio, cellule tumorali, cellule staminali, cellule T) sono progettate per esprimere luciferasi e illuminarsi. La visualizzazione non invasiva in animali vivi utilizzando una fotocamera sensibile a dispositivo ad accoppiamento di carica rende quindi possibile l’osservazione in tempo reale della progressione e della regressione della malattia in diversi momenti nel corso del trattamento terapeutico. Impiegata per comprendere le basi molecolari di patologie come i disturbi neurodegenerativi, i disturbi cardiovascolari, l’obesità e il cancro, questa tecnica è di immenso valore per lo sviluppo clinico, diagnostico e farmacologico.

Gli scienziati di Regis Technologies hanno identificato le debolezze comuni nei test della luciferasi. I problemi spesso si verificano prima dell’inizio del test. La lucciola luciferina è una molecola sensibile, e anche gli esperimenti ben pianificati possono dare risultati errati se la luciferina è maneggiata male e danneggiata prima dell’uso. In questo articolo, descriviamo il sale ottimale, la purezza, la manipolazione e la conservazione di luciferina per garantire risultati di successo e coerente in imaging animale e altri saggi.

considerazioni di acquisto

Ricercatori spesso chiedono quale forma di luciferina da utilizzare. I sali di potassio e di sodio della luciferina sono di solito usati in modo intercambiabile. Tuttavia, la dissoluzione della molecola è un fattore importante da considerare per alcuni saggi. Il sale di sodio è più solubile in acqua (>100 mg/mL) rispetto al sale di potassio (55 mg/mL). La forma acida libera, mentre ancora disponibile, non è spesso usato a causa della sua difficoltà di dissoluzione.

Perché alcune impurità possono impattare gli esperimenti in modi diversi, la purezza iniziale del reagente può essere una considerazione importante.

L-luciferina, un enantiomero di D-luciferina (Figura 1), è una impurità nota in luciferina sintetica. Anche se ha dimostrato di funzionare in reazioni luciferasi, uno spostamento significativo in emissione di luce di picco è probabile che si verifichi a seconda dei parametri di raccolta dati utilizzati. L-luciferina è facilmente rilevato e quantificato da HPLC chirale e dovrebbe essere riportato sul certificato di analisi del produttore. La maggior parte luciferina dovrebbe contenere meno dello 0,5% L-luciferina, anche se i limiti più elevati possono probabilmente essere tollerati fino a quando i livelli di L-luciferina rimangono costanti per tutto l’esperimento.

Dehydroluciferin (Figura 1) è un’impurità che agisce come un inibitore della luciferasi, sopprimendo l’altezza flash e integrazione totale. Un campione drogato con l’1% di deidroluciferina mostra meno della metà dell’altezza del flash e meno del 25% dell’integrazione totale su 15 minuti. Deidroluciferina può formare durante la sintesi o lo stoccaggio di luciferina. Selezionando un produttore che fornisce bassi livelli di deidroluciferina contribuirà a garantire risultati affidabili e ripetibili.

Molte impurità traccia comune dalla sintesi di luciferina può inibire altri enzimi in sistemi complessi e può causare variabilità sperimentale a causa di lotto a lotto o produttore a produttore differenze.

Figura 1. Confronto strutturale di D-luciferina e impurità

Stoccaggio

La luciferina è sensibile alla luce, ossigeno e umidità e deve essere protetta. La luce e l’ossigeno possono catalizzare l’ossidazione della luciferina a deidroluciferina. Lasciato in una bottiglia d’ambra sotto azoto a temperatura ambiente, luciferina inizierà a decomporsi a deidroluciferina dopo un mese (Figura 2), ma è stabile in una bottiglia non aperta per almeno due anni in un congelatore. Disciolto in acqua con sufficiente ossigeno, luciferina si converte in deidroluciferina in pochi giorni.

Luciferina dovrebbe essere acquistato e conservato nella quantità più piccola possibile per evitare la decomposizione in deidroluciferina da più cicli di congelamento-disgelo-aperto. Se acquistato in massa, dividendo il reagente luciferina in fiale ambra monouso aiuterà a garantire la stabilità. Conservazione a lungo termine come una soluzione congelata non è raccomandato per applicazioni sensibili come studi di animali interi. Per aiutare la decomposizione lenta in soluzioni congelate, sparge la soluzione con azoto o argon prima di congelare.

Figura 2. Figura 2. Decomposizione della luciferina in deidroluciferina in funzione del tempo a 25ºC e -20ºC

Manipolazione

Ogni volta che viene aperta, la bottiglia di luciferina deve essere lasciata arrivare completamente a temperatura ambiente e poi spurgata con azoto o argon prima di essere risigillata. Se le soluzioni luciferina devono essere utilizzati entro poche ore, poche precauzioni sono necessarie. Le soluzioni che saranno utilizzati più di un giorno dovrebbe essere spruzzato con azoto o argon. Le soluzioni non dovrebbero essere utilizzate per più giorni, in quanto si verificherà la formazione di deidroluciferina.

Scott B. Mohler ([email protected]) è un product manager presso Regis Technologies. Sito web: www.registech.com.