La nostra conoscenza dell’origine e dell’identità cellulare delle cellule di schiuma in vivo è sorprendentemente limitata considerando la natura ubiquitaria di queste cellule nelle lesioni aterosclerotiche e il loro ruolo critico nella patogenesi delle lesioni, comprese le conseguenze cliniche in fase avanzata come l’infarto miocardico o l’ictus. In studi patologici umani su lesioni avanzate,1 le cellule schiumose, o cellule ricche di lipidi, sono state identificate per la prima volta come macrofagi utilizzando anticorpi monoclonali contro CD68, CD45 e HLA classe II (cluster di differenziazione 68, cluster di differenziazione 45 e antigene leucocitario umano classe II).2 Tuttavia, questi sono stati rapidamente seguiti da studi con anticorpi migliorati per l’actina che hanno riportato che anche le cellule muscolari lisce (SMC) potrebbero dare origine a cellule schiumose, sia in lesioni umane in stadio avanzato che in quello iniziale.3,4 Tuttavia, recenti studi di lineage tracing del nostro laboratorio5-7 e di altri8 hanno dimostrato che l’utilizzo dei soli geni marcatori per assegnare l’origine delle cellule non è un approccio affidabile nel contesto di una lesione aterosclerotica. Infatti, è stato dimostrato che le SMC possono perdere i loro marcatori contrattili ed esprimere marcatori macrofagi come il CD68,5 le cellule endoteliali e i macrofagi possono subire una transizione mesenchimale ed esprimere marcatori SMC,9-11 e alcune cellule nelle lesioni umane esprimono sia CD68 che ACTA2 (alfa 2 actina) confondendo ulteriormente la nostra comprensione circa le origini delle cellule schiumose all’interno delle lesioni.5,12

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In questo numero di Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology, Wang et al13 forniscono prove interessanti che dal 60% al 70% delle cellule schiumose nelle lesioni aterosclerotiche del topo sono di origine SMC e non leucocitaria. È importante notare che le conclusioni si basano su un uso impressionante di metodi complementari tra cui topi che tracciano il lignaggio delle SMC, metodi citometrici a flusso specializzati che preservano le cellule schiumose di origine leucocitaria e non leucocitaria, e la dimostrazione che le cellule schiumose derivate dalle SMC sembrano essere negative per il marker CD45 dei leucociti. Quest’ultima osservazione è importante perché lo stesso gruppo ha precedentemente dimostrato che >50% delle cellule schiumose nelle lesioni coronariche umane avanzate sono ACTA2+ CD68+ ma CD45-, suggerendo che le cellule derivate da non leucociti sono anche la fonte principale di cellule schiumose nelle lesioni umane, non i monociti-macrofagi come è stato a lungo ipotizzato.14,15 Sebbene i dati del topo appaiano convincenti, l’interpretazione dei dati umani rimane controversa perché dipende completamente dal presupposto non dimostrato che tutte le cellule schiumose derivate dai leucociti nelle lesioni umane mantengano l’espressione di CD45. Un’ulteriore limitazione è l’incapacità di fare un rigoroso lineage tracing negli studi umani. Il nostro laboratorio ha precedentemente sviluppato un metodo epigenetico che permette di individuare le cellule derivate dalle SMC basandosi sul rilevamento di H3K4diMe (dimetilazione della lisina 4 sull’istone 3) della regione promotrice di Myh11 (catena pesante della miosina 11) nelle sezioni istologiche.6 Tuttavia, questo metodo avrà un’utilità limitata per l’analisi delle cellule di schiuma perché, come indicato da Wang et al, è praticamente impossibile distinguere le singole cellule di schiuma nelle lesioni avanzate. Quindi, come potrebbero essere risolti questi limiti intrinseci?

Crediamo che la soluzione sarà trovata sulla base di analisi RNAseq unbiased single-cell (scRNAseq) di lesioni umane avanzate combinate con studi complementari scRNAseq, citometrici a flusso e citometrici di massa (CyTOF) di lesioni avanzate da topi aterosclerotici che tracciano la stirpe SMC. Anche se ci sono stati recentemente un certo numero di studi scRNAseq di lesioni aterosclerotiche, finora crediamo che questi hanno avuto grandi limitazioni per quanto riguarda la risoluzione della controversia decenni lungo come la fonte principale cellulare di cellule di schiuma. Questi dati evidenziano le intuizioni uniche offerte dalle nuove tecniche, ma invitano anche alla cautela nell’interpretare questi e altri studi e suggeriscono che un’ulteriore esplorazione dell’identità e delle proprietà delle cellule utilizzando un rigoroso lineage tracing con scRNAseq e saggi avanzati a livello proteico è un’area cruciale per la ricerca futura.

Wang et al hanno usato la fissazione dei lipidi seguita dalla colorazione BODIPY (boron-dipirrometene) e dalla citometria a flusso per tentare di quantificare e caratterizzare le cellule di schiuma nelle aorte aterosclerotiche da topi alimentati con dieta occidentale o invecchiati ApoE-/-. Una tecnica simile è stata utilizzata da Kim et al16 per isolare BODIPY + SSChi cellule di schiuma da aorte aterosclerotica murina per l’analisi di RNAseq singola cella. Importante, entrambi gli studi analizzati intere aorte non lesioni in modo che la maggior parte delle cellule analizzate non sono derivati da lesioni aterosclerotiche di per sé, ma piuttosto riflettono popolazioni complessive di cellule in lesioni, media e avventizia. Inoltre, Kim et al si sono concentrati sulle cellule CD45+ ordinate per profilare le popolazioni di macrofagi nell’aorta murina che, naturalmente, avrebbero escluso le cellule di schiuma derivate dalle SMC descritte da Wang et al. Il gruppo ha incluso i dati scRNAseq su tutte le cellule di schiuma BODIPY+SSChi nel supplemento. È interessante notare che questi dati mostrano cellule positive per ACTA2 e Sm22a che potrebbero essere le cellule schiumose non derivate dai leucociti descritte da Wang et al nei loro studi. Tuttavia, è importante notare che i risultati di scRNAseq potrebbero non essere un metodo affidabile per quantificare l’origine delle cellule di schiuma perché Winkels et al hanno trovato prove basate sulla deconvoluzione dell’RNAseq di massa che le tecniche standard di scRNAseq sotto-campionano macrofagi e monociti del ≈65%.17 Questo potrebbe essere uno dei motivi principali per cui gruppi particolarmente interessati alle popolazioni di macrofagi avrebbero bisogno di concentrare queste cellule utilizzando la citometria a flusso prima dell’analisi, una tecnica seguita in diversi articoli recenti che descrivono leucociti all’interno dei vasi sanguigni aterosclerotici.16-18 Tuttavia, tali approcci sono suscettibili di compromettere il potere potenziale di scRNAseq per rilevare la diversità del tipo di cellule e scoprire l’importanza delle popolazioni di cellule precedentemente sconosciute nella malattia. Infatti, i nostri pregiudizi preconcetti non si applicano solo all’ingresso delle cellule, ma anche all’interpretazione dei dati scRNAseq, in cui gli investigatori ottengono un intero trascrittoma di popolazioni di cellule aortiche o di lesioni e poi procedono a nominare il tipo di cellula in base all’uso di pochi, familiari marcatori. Questo vanifica lo scopo di una tecnologia intesa a separare gruppi basati su centinaia o migliaia di geni e può anche portare a confusione per i gruppi che studiano popolazioni simili di cellule.19,20 Quest’ultima questione è particolarmente problematica data l’inaffidabilità ormai consolidata dell’uso di pochi geni marcatori convenzionali e familiari per identificare i tipi di cellule nelle lesioni aterosclerotiche in fase avanzata.5,9-11 Infatti, Wang et al riconoscono che il 20% delle cellule schiumose non-SMC non esprimono nemmeno il CD45, indicando che potrebbero derivare da un’altra fonte o da macrofagi che non esprimono più il CD45. Nessuna tecnica è completamente imparziale e quindi l’uso di più tecniche complementari tra cui il lineage tracing, la colorazione immunoistochimica, la citometria a flusso, il CyTOF e il sequenziamento devono essere il gold standard per gli studi futuri che indagano l’identità cellulare nell’aterosclerosi.

L’ambiguità nell’identificazione delle cellule basata sull’uso di uno o pochi geni marcatori può anche avere implicazioni terapeutiche critiche. Cioè, una terapia che può avere effetti benefici in alcune cellule può avere effetti dannosi su altre cellule. Questo è chiaramente esemplificato in un recente articolo di Nature Medicine del nostro gruppo21 che ha mostrato inaspettatamente che l’investimento e la ritenzione di SMC all’interno del cappuccio fibroso delle lesioni aterosclerotiche avanzate dipendono dalla segnalazione di IL-1b e del recettore IL-1. Al contrario, è anche ben stabilito che IL-1b contribuisce allo sviluppo dell’aterosclerosi.22 Allo stesso modo, Wang et al hanno dimostrato che ABCA1 (ATP-binding cassette A1) è stato downregolato nelle cellule di schiuma CD45-negative, il che, secondo gli autori, potrebbe essere un meccanismo per il loro accumulo di lipidi nel tempo. Forse le sottili differenze nella capacità dei tipi di cellule di rispondere al microambiente della placca sono cruciali per la patogenesi della lesione, poiché i tipi di cellule che svolgono il lavoro sbagliato rimangono intrappolati. Infatti, postuliamo che le cellule simili ai macrofagi derivate dalle SMC siano dei poveri sostituti delle cellule fagocitanti professionali e finiscano per essere ingorgate di lipidi ma abbiano una capacità limitata di smaltirli (Figura).

In sintesi, gli studi qui riportati da Wang et al forniscono un importante collegamento tra le osservazioni delle cellule schiumose nelle lesioni umane e i modelli murini e suggeriscono un ruolo sottovalutato delle SMC nella formazione delle cellule schiumose. Le conclusioni di Wang et al forniscono prove convincenti che è necessaria molta più ricerca in questo settore. Speriamo che attraverso l’uso combinato di modelli avanzati di lineage tracing nei topi e di profili trascrizionali e proteomici imparziali delle cellule della lesione, possiamo definire più accuratamente le origini e le funzioni dei diversi tipi di cellule presenti nelle lesioni e sviluppare nuovi potenti approcci terapeutici per migliorare la stabilità della placca e ridurre le complicazioni trombotiche in fase avanzata dell’aterosclerosi.

Footnotes