Introduzione

La presenza di vertebre è una caratteristica che definisce la pianta del corpo dei vertebrati. Uno scheletro vertebrale può consistere in una serie di archi neurali appaiati che coprono il midollo spinale, archi ematici appaiati che racchiudono l’arteria e la vena caudale, e, in molti vertebrati con mascelle (gnatostomi), una serie di centra che sostituiscono la notocorda come struttura di supporto predominante. I centra vertebrali sono altamente variabili in termini di morfologia e composizione del tessuto, e probabilmente si sono evoluti indipendentemente in molti diversi lignaggi di gnatostomi, tra cui tetrapodi, pesci teleostei e pesci cartilaginei. Questa apparente convergenza evolutiva solleva domande sull’origine embrionale degli elementi scheletrici vertebrali negli gnatostomi.

Nei tetrapodi, tutti i componenti dello scheletro vertebrale derivano dai somiti: blocchi transitori e bilaterali di mesoderma parassiale segmentato che si formano dorsalmente nel tronco embrionale. I somiti sono suddivisi in suddivisioni dorsali e ventrali che danno origine al tessuto connettivo e alla muscolatura del tronco (‘dermomyotome’) e ai tessuti scheletrici (‘sclerotome’), rispettivamente. Esperimenti di tracciatura del lignaggio cellulare usando chimere di pulcino-quaglia e iniezioni di fluoresceina-destrano o innesti da embrioni donatori GFP-transgenici in axolotl hanno dimostrato un’origine completamente somitica dello scheletro vertebrale in questi taxa, con cellule di derivazione somitica recuperate negli archi in sviluppo e nella cartilagine nascente dei centra.

Inversamente, nei pesci teleostei con pinne raggiate, lo scheletro vertebrale sembra avere una doppia origine embrionale, con contributi sia dal mesoderma parassiale che dalla notocorda. I centri vertebrali dei teleostei sono costituiti da uno strato interno (il cordacentro) e uno strato esterno, entrambi composti da osso che si forma per ossificazione intramembranosa. Il chordacentrum dei teleostei si forma per primo, attraverso la secrezione di proteine della matrice ossea (ad esempio SPARC, collagene di tipo I) da cellule “chordoblast” che risiedono all’interno dell’epitelio della notocorda. Nel pesce zebra, saggi in vitro hanno dimostrato che le cellule notocordali coltivate hanno la capacità di secernere matrice ossea, e gli esperimenti di ablazione hanno dimostrato che in assenza di notocorda, cordacentri non riescono a formare. I cordacentri dei teleostei sono successivamente circondati da uno strato relativamente tardivo di membrana ossea derivata dal mesoderma parassiale. Inoltre, i mutanti di zebrafish con difetti di patterning somite possiedono cordacentri che si sviluppano normalmente, ma mostrano profondi difetti dell’arco neurale ed ematico, indicando la probabile origine mesodermica parassiale dei tessuti dell’arco.

Per determinare se la doppia origine dei centraggi vertebrali è una caratteristica specifica dei teleostei dello scheletro vertebrale, o una caratteristica generale per gli gnatostomi che è stata persa nei tetrapodi, sono necessari dati sull’origine embrionale delle vertebre da un outgroup dei pesci ossei (cioè Osteichthyes: il gruppo che comprende tetrapodi e teleostei). I pesci cartilaginei (Chondrichthyes: squali, razze e olocefali) occupano una posizione filogenetica chiave come gruppo gemello dei pesci ossei, e i dati di questo lignaggio possono quindi essere utilizzati per aiutare a dedurre le condizioni primitive di sviluppo dell’ultimo antenato comune degli gnatostomi. Abbiamo precedentemente dimostrato che le vertebre nella piccola razza (Leucoraja erinacea) consistono ciascuna di una spina neurale dorsale, due serie di cartilagini dorsali che racchiudono il midollo spinale (archi neurali e intercalari), un singolo arco ematico e una spina che si estende ventralmente, e un centrum a tre strati (figura 1). Qui, usiamo esperimenti di mappatura del destino di somiti e notocorda, così come l’ibridazione di mRNA in situ per i geni che codificano le proteine della matrice scheletrica, per verificare l’origine embrionale dello scheletro vertebrale dello skate. Mostriamo che tutti i componenti dello scheletro vertebrale dei razze derivano dal mesoderma parassiale, senza prove di contributi cellulari o di matrice dalla notocorda. Se considerati insieme ai dati dei pesci ossei, i nostri risultati indicano un’origine mesodermica parassiale generale e probabilmente primitiva della colonna vertebrale nei vertebrati con mandibola.

Materiale e metodi

(a) Mappatura del destino dei somiti

Gli embrioni di Leucoraja erinacea sono stati ottenuti dal Marine Biological Laboratory (MBL) di Woods Hole, MA, e tenuti in una tavola marina a circa 16°C fino alla S24. Un lembo è stato tagliato nella custodia dell’uovo utilizzando una lama di rasoio, e l’embrione e il tuorlo sono stati trasferiti in un piatto Petri. Gli embrioni sono stati anestetizzati in una soluzione di MS-222 (100 mg l-1 etil 3-aminobenzoato metanesulfonato-Sigma-Aldrich) in acqua di mare. CellTracker CM-DiI (Thermofisher) (5 µg µl-1 in etanolo) è stato diluito 1 : 10 in saccarosio 0.3 M e iniettato nelle porzioni ventrali dei somiti (uno a tre iniezioni per embrione) utilizzando un ago capillare di vetro tirato e un iniettore a pressione Picospritzer (figura 2a). Gli embrioni sono stati poi sostituiti nelle loro custodie per le uova e restituiti alla tavola di mare per svilupparsi per circa 7 o 12 settimane. Gli embrioni sono stati poi fissati con 4% PFA, come descritto in Criswell et al.

(b) Notochord fate mapping

Embrioni sono stati tenuti come descritto sopra fino a S14, a quel punto una piccola finestra è stata tagliata nel caso uovo sopra l’embrione. CM-DiI è stato microiniettato nel triangolo notocorda come descritto sopra (figura 2b). La finestra è stata poi sigillata con guscio d’uovo donatore e gel Krazy Glue ™ (figura 2c), e le uova sono stati restituiti al tavolo mare per sviluppare per un ulteriore 16-18 settimane prima della fissazione (come descritto in Criswell et al. ).

(c) Convalida del posizionamento dell’iniezione CM-DiI

Per verificare il corretto posizionamento delle iniezioni CM-DiI, tre embrioni iniettati con somiti sono stati fissati immediatamente dopo l’iniezione, e tre embrioni iniettati con notochord sono stati fissati 5 giorni dopo l’iniezione (dpi). Gli embrioni sono stati fissati in paraformaldeide 4% in PBS per una notte a 4 ° C, sciacquati 3 × 15 min in PBS e colorati con DAPI a 1 µg ml-1 per una notte a temperatura ambiente. Somite-iniettato embrioni sono stati ripresi su un microscopio Zeiss lightsheet e notochord-iniettato embrioni sono stati ripresi su Zeiss lightsheet o microscopi confocali LSM 780.

(d) Istologia e mRNA in situ ibridazione

CM-DiI-labelled L. erinacea embrioni sono stati incorporati in paraffina e sezionato a 8 µm di spessore come descritto in O’Neill et al. per analisi istologica. Prima dell’inclusione, gli embrioni sono stati demineralizzati in EDTA (acido etilendiamminotetraacetico) al 10% per 14 giorni. Colorazione istochimica è stata eseguita seguendo il protocollo tricromico di Masson di Witten e Hall. Esperimenti di ibridazione in situ per Col1a1 (numero di adesione GenBank MG017616) e SPARC (numero di adesione GenBank MG017615) sono stati eseguiti su sezioni come descritto in O’Neill et al. , con modifiche secondo Gillis et al.

Risultati

(a) Contributo somitico a tutte le componenti dello scheletro vertebrale dello skate

Per verificare il contributo somitico allo scheletro vertebrale dello skate, abbiamo microiniettato CM-DiI in porzioni ventrali dei somiti (cioè il presunto sclerotomo-figura 3a) di embrioni di skate allo stadio (S) 24 (Ballard et al. ). Etichettatura focale dei somiti (senza contaminazione notocordale) è stata confermata da microscopia a fogli di luce, in embrioni fissati immediatamente post-iniezione (figura 3b; n = 3). Da 50-52 dpi (S31), cellule a forma di fuso del tessuto areolare in via di sviluppo del centrum circondano la notocorda, e mesenchima prescheletrico si è condensato intorno al tubo neurale e arteria caudale e vena. In tutti gli embrioni analizzati a questo stadio (n = 5), CM-DiI è stato recuperato nelle cellule fusiformi del tessuto areolare in via di sviluppo (figura 3c), indicando la loro origine somitica.

Entro 109 dpi (S34), le vertebre sono completamente sviluppate, con archi neurali, intercalari ed ematici, e un centrum a tre strati (figura 1). Negli embrioni analizzati a questo stadio (n = 4), le cellule CM-DiI-positive sono state recuperate in tutto lo scheletro vertebrale. CM-DiI-cellule positive sono state recuperate nella cartilagine del neurale (n = 3 vertebre in tre embrioni) e archi ematici (n = 6 vertebre in quattro embrioni; figura 3d,e), così come nello strato interno della cartilagine (figura 3f; n = 2 vertebre in due embrioni), il tessuto areolare medio (figura 3g; n = 3 vertebre in tre embrioni) e la cartilagine esterna del centrum (figura 3h; n = 3 vertebre in tre embrioni). Presi insieme, questi risultati dimostrano il contributo somitico a tutti i principali componenti dello scheletro vertebrale dello skate.

(b) Nessuna prova per il contributo notocordale allo scheletro vertebrale nello skate

Per verificare i contributi cellulari della notocorda allo scheletro vertebrale dello skate, abbiamo condotto una serie di esperimenti di mappatura del destino della notocorda. Nei pesci cartilaginei, la notocorda deriva da una piccola regione triangolare di cellule progenitrici (il “triangolo della notocorda”) che appare al margine posteriore del blastodisco a S12 . Abbiamo etichettato focalmente il triangolo della notocorda degli embrioni di razza con CM-DiI a S14 (figura 4a), e abbiamo confermato la localizzazione del colorante alla notocorda a 5 dpi (circa S17) usando la microscopia confocale. In tre embrioni esaminati a S17, CM-DiI è stato trovato solo nella notocorda (n = 2), o nella notocorda e tessuto neurale (n = 1) (figura 4b). In nessun caso sono state rilevate cellule marcate CM-DiI nel mesoderma parassiale.

Abbiamo quindi etichettato i triangoli della notocorda di diversi embrioni di razza a S14, e allevato questi embrioni a 116-129 dpi (S34 – a quel punto lo scheletro vertebrale si è completamente differenziato). CM-DiI è stato recuperato all’interno della notocorda (figura 4c,c′) e l’epitelio della notocorda (figura 4d,d′) delle regioni intervertebrali della colonna assiale (n = 5). In tre embrioni, CM-DiI-positive cellule sono state recuperate nei resti di epitelio notocorda che persistono nel centro del centrum, dove la notocorda è quasi completamente sostituito da cartilagine centrum strato interno, ma non CM-DiI-positivi condrociti sono stati recuperati nello strato interno della cartilagine stessa. Non sono stati osservati condrociti marcati CM-DiI in nessun altro componente della colonna assiale. Questi esperimenti, quindi, non forniscono alcuna prova di un contributo cellulare dalla notocorda allo scheletro vertebrale.

Nei teleostei, le cellule del cordoblasto all’interno dell’epitelio della notocorda secernono componenti della matrice che costituiscono l’osso acellulare del cordacentro. Anche se le razze non possiedono un cordacentrum, il tessuto areolare del centrum della razza si mineralizza, e alla sua origine si trova adiacente all’epitelio della notocorda. Per verificare se le cellule epiteliali della notocorda contribuiscono ai componenti della matrice al tessuto del centrum nel pattino, abbiamo caratterizzato l’espressione dei geni che codificano le proteine della matrice ossea Col1a1 e SPARC nel centra in sviluppo del pattino. Non abbiamo rilevato la trascrizione di Col1a1 (figura 5a) o SPARC (figura 5b) nell’epitelio della notocorda. Piuttosto, queste trascrizioni si sono localizzate nelle cellule a forma di fuso del tessuto areolare (figura 5a, b). Questi risultati suggeriscono che le cellule derivate dal mesoderma parassiale del tessuto areolare stesso – e non l’epitelio della notocorda – sono la fonte della matrice extracellulare del tessuto mineralizzato del centro vertebrale della razza.

Discussione

I nostri esperimenti di mappatura del destino dei somiti dimostrano che lo sclerotomo presuntivo contribuisce a tutti i componenti delle vertebre nella razza, compresi gli archi neurali ed ematici, e tutti i tessuti del centro vertebrale a tre strati. Mentre è possibile che DiI potrebbe diffondere attraverso la matrice extracellulare dopo l’iniezione per contaminare i tessuti adiacenti al bersaglio previsto (ad esempio notocorda), abbiamo controllato per questa possibilità di imaging un sottoinsieme di embrioni poco dopo l’iniezione per convalidare la precisione della nostra etichettatura, e di eseguire complementari esperimenti di mappatura destino notocorda. In quest’ultimo, troviamo che CM-DiI etichettatura delle cellule progenitrici notocorda portato esclusivamente in etichettatura della notocorda e l’epitelio notocorda, senza alcun contributo ai tessuti vertebrali. Nei pesci teleostei, le cellule cordoblasto all’interno dell’epitelio notocorda esprimono i geni che codificano le proteine della matrice ossea di tipo I collagene e SPARC, e sono probabilmente la fonte di matrice ossea per il primo strato del centro vertebrale. Poiché i pattini possiedono anche uno strato mineralizzato all’interno del loro centra vertebrale, abbiamo cercato di verificare l’espressione di Col1a1 e SPARC durante lo sviluppo vertebrale del pattino mediante ibridazione mRNA in situ. Abbiamo trovato questi geni ad essere espressi esclusivamente all’interno delle cellule somiticamente derivate a forma di fuso del tessuto areolare (il precursore dello strato medio mineralizzato del centrum-Criswell et al. ), e non nell’epitelio della notocorda. Questi risultati suggeriscono che le cellule e i componenti della matrice del centrum vertebrale dei pattini sono interamente di origine mesodermica parassiale.

Se considerato insieme ai dati dei pesci ossei, la nostra dimostrazione di un’origine somitica dello scheletro vertebrale dei pattini suggerisce che questo tessuto era probabilmente l’unica fonte primitiva dei tessuti scheletrici vertebrali negli gnatostomi, con un contributo della notocorda al centrum che rappresenta una condizione derivata dei pesci teleostei (figura 6). L’evidenza dai primi pesci fossili con e senza mascella suggerisce fortemente che lo scheletro vertebrale nell’ultimo antenato comune degli gnatostomi consisteva semplicemente in una serie di archi neurali e una notocorda persistente, senza centra. Diversi lignaggi di gnatostomi, compresi i pesci cartilaginei elasmobranchi, i teleostei e i tetrapodi, hanno successivamente evoluto i centraggi indipendentemente l’uno dall’altro. Alle loro origini, i centri vertebrali degli elasmobranchi e dei tetrapodi derivano interamente dal mesoderma parassiale, ma uno strato interno di osso acellulare derivato dalla notocorda è stato incorporato nel centro con l’origine indipendente dei centri dei teleostei.

Non è ancora chiaro, tuttavia, se questa condizione specializzata dei teleostei sia unica tra i pesci con le pinne raggiate. Nonostante le recenti modifiche ai modelli filogenetici, i centraggi vertebrali molto probabilmente si sono evoluti in modo indipendente in più lignaggi di pesci con le pinne raggiate non teleostei (ad esempio, in gars e bichir). Ma, non è chiaro se la notocorda contribuisce tessuto alle diverse forme di centra osservate in questi taxa. Analisi complete delle origini embrionali dei tessuti vertebrali in taxa di pesci strategicamente selezionati sono necessarie per risolvere meglio l’assemblaggio evolutivo e di sviluppo della diversa gamma di scheletri assiali, probabilmente la caratteristica chiave, dei vertebrati in generale.

Etica

Tutto il lavoro sperimentale è stato fatto in conformità ai protocolli approvati dal Comitato per la cura e l’uso degli animali al MBL.

Accessibilità dei dati

I dati di sequenza associati ai geni di questo studio sono disponibili su GenBank (numero di adesione Col1a1 MG017616 e numero di adesione SPARC MG017615).

Contributi degli autori

K.E.C. concepito lo studio, eseguito istologia, mappatura del destino ed esperimenti di ibridazione in situ e redatto il manoscritto; M.I.C. coordinato lo studio e fornito input sul manoscritto; J.A.G. progettato porzioni dello studio, coordinato lo studio e aiutato a scrivere il manoscritto. Tutti gli autori hanno dato l’approvazione finale per la pubblicazione.

Interessi concorrenti

Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.

Finanziamento

Questo studio è stato sostenuto da una National Science Foundation DDIG (DEB 1501749), un University of Chicago/Marine Biological Laboratory Graduate Student Research Award, una Company of Biologists Travelling Fellowship, e una Royal Society-Shooter International Fellowship (NF160762) a K.E.C.; una Royal Society University Research Fellowship (UF130182), un Isaac Newton Trust Grant (14.23z) e Marine Biological Laboratory Plum Foundation John E. Dowling e Laura and Arthur Colwin Research Fellowships a J.A.G.e una sovvenzione della National Science Foundation (DEB 1541491) e fondi di ricerca dell’Università di Chicago a M.I.C.

Footnotes