Sinonimi

Acidi grassi non esterificati (NEFA), acidi grassi liberi, acidi grassi insaturi

Fisiologia

Gli acidi grassi non esterificati (“liberi” o insaturi) (NEFA) sono il componente principale dei trigliceridi (le riserve di grasso nel corpo), che consistono di tre acidi grassi legati a una spina dorsale di glicerolo. Negli animali sani (quando mangiano o non sono in stato di carenza energetica), i NEFA provengono principalmente dalla scomposizione dei trigliceridi ingeriti nella dieta attraverso i chilomicroni (la lipoproteina lipasi libera i NEFA dai resti dei chilomicroni). Tuttavia, in condizioni di digiuno o in stati di bilancio energetico negativo, la fonte principale di NEFA è l’idrolisi dei depositi di grasso nel corpo.

L’idrolisi dei trigliceridi immagazzinati (grasso) nel tessuto adiposo da parte della lipasi ormono-sensibile libera NEFA e glicerolo. La lipasi ormono-sensibile (che si trova nel citosol degli adipociti) è stimolata da vari ormoni, tra cui il glucagone (che viene rilasciato dalle cellule α nelle isole pancreatiche in risposta al basso livello di glucosio) e dai corticosteroidi. Una volta liberati dal grasso o dai chilomironi, i NEFA possono essere utilizzati come fonte di energia da molti tessuti, compresi i muscoli scheletrici e gli epatociti. Negli epatociti, il loro destino differisce a seconda del fabbisogno energetico, dell’equilibrio ormonale e della disponibilità del substrato, cioè possono essere utilizzati per la produzione di energia (attraverso il ciclo di Kreb), riconfezionati in trigliceridi ed esportati come lipoproteine a bassissima densità (VLDL) o immagazzinati all’interno del fegato come trigliceridi (che in eccesso possono causare lipidosi epatica) o convertiti in chetoni.

Metodologia

Il metodo principale per misurare la concentrazione di NEFAs nel siero è un metodo enzimatico colorimetrico, che è il metodo usato alla Cornell University.

Tipo di reazione

Reazione punto finale in bianco. Il blanking diminuisce l’effetto dell’emolisi sulle concentrazioni di NEFA.

Procedura usata alla Cornell University

Nella prima fase di questa reazione a tre stadi, l’acil-CoA sintetasi (ACS) catalizza l’acilazione dei NEFA al (coenzima A) CoA con conseguente formazione di acil-CoA. Il perossido di idrogeno è poi generato dall’ossidazione dell’acil-CoA attraverso l’azione catalitica dell’acil-CoA ossidasi (ACOD). Infine, il perossido di idrogeno in presenza di perossidasi (POD) permette la condensazione ossidativa della 4-aminoantipirina con la 3-metil-N-etil-N-(β-idrossietil)-anilina (MEHA) per formare un prodotto finale blu-viola con un massimo di assorbimento a 550 nm. La concentrazione di NEFA è direttamente proporzionale alla densità ottica misurata del prodotto colorante.

Le reazioni sono riportate di seguito:

NEFA+ ATP + CoA acil-CoA sintetasi > Acil-CoA + AMP + pirofosfato

Acil-CoA + O2 + acil-CoA ossidasi > 2,3-trans-Enoil-CoA + H2O2

2H2O2 + 4-aminoantipirina + MEHA perossidasi > complesso blu-viola+ 3H2O

Unità di misura

La concentrazione dei NEFA è misurata in mEq/L (unità convenzionali) o mmol/L (unità SI). La conversione delle unità si ottiene dalla seguente formula:

mEq/L x 1= mmol/L

Considerazioni sul campione

Tipo di campione

Siero o plasma EDTA. Il siero/plasma deve essere separato dalle cellule il prima possibile dopo la raccolta e il siero/plasma deve essere messo in una provetta separata. Allo stesso modo, le provette corvac (siero-separatore) non sono raccomandate, perché i valori sono leggermente (ma significativamente) più alti in queste provette rispetto a quelle non anticoagulanti (red top).

Anticoagulante

EDTA. I valori sono meno stabili nell’eparina, che produce anche concentrazioni di base più alte rispetto all’EDTA o al siero e i valori NEFA aumentano con la conservazione (Stokol e Nydam 2005).

Stabilità

Stabile in siero bovino o plasma EDTA a 4°C per 72 ore. Stabile congelato in siero bovino per 1 mese (-70°C). I valori aumentano entro 24-48 ore dalla conservazione a 24°C nel siero o nel plasma EDTA. Le concentrazioni di NEFA aumentano rapidamente nell’eparina dopo la conservazione. (Stokol e Nydam 2005).

Raccomandazioni per la raccolta di campioni nelle vacche da latte di transizione

• Anticoagulante: Top rosso (siero) o top viola (EDTA). Evitare le provette con eparina (parte superiore verde) e corvac (separatore di siero).
• Manipolazione: Separare dalle cellule il prima possibile, tenere al fresco per minimizzare i falsi cambiamenti nei risultati (i NEFA sono particolarmente instabili), inviare il prima possibile al laboratorio.
• Tempo di raccolta: Campionare le vacche mentre entrano nelle stalle di alimentazione (vedi sotto).
  • NEFA prepartum: Raccogliere campioni dalle vacche 2-14 giorni prima del parto.
  • Nefa post-partum: Raccogliere campioni dalle vacche 3-14 giorni nel latte. La misurazione di entrambi i NEFA postpartum e BHB viene eseguita in un profilo energetico della vacca di transizione per la valutazione dello stato energetico nelle vacche in lattazione presso il laboratorio di patologia clinica della Cornell University.
• Numero di vacche: Un minimo di 12 animali per mandria dovrebbe essere campionato per il test a livello di mandria (descrizione del test nella sezione interpretazione del test di seguito). Questo può essere un misto di giovenche e >2 vacche di parità.
• Campioni raggruppati: Il raggruppamento di campioni individuali di vacche per valutare lo stato energetico di una mandria NON è raccomandato. Gli studi della Cornell University hanno dimostrato che i risultati dei campioni raggruppati sono meno sensibili dei test sulle singole vacche (minimo 12 animali per mandria) quando si usa il NEFA pre-partum o post-partum per il rilevamento di un eccessivo bilancio energetico negativo nelle vacche da latte in transizione.

Interferenze

• Lipemia, ittero: Effetto sconosciuto (raro nei bovini).
• Emolisi: A seconda del metodo usato dal laboratorio, l’emolisi diminuisce o aumenta i valori di NEFA. Nel metodo in bianco usato alla Cornell University, l’emolisi grave (indice emolitico > 800 unità) diminuirà leggermente le concentrazioni di NEFA nel sangue bovino. Gli interferenti lipemici e itterici non influenzano sostanzialmente la concentrazione di NEFAs con i metodi usati dalla Cornell University.
• Eccitazione/esercizio/stress: Queste condizioni, che inducono il rilascio di catecolamine o ACTH, aumentano le concentrazioni di NEFA stimolando la lipolisi attraverso la lipasi sensibile agli ormoni. Queste condizioni dovrebbero essere ridotte al minimo quando si raccolgono campioni di sangue per la misurazione del NEFA.
• Tempi di raccolta dei campioni: I valori di NEFA sono probabilmente più alti nelle vacche che arrivano per l’alimentazione giornaliera (probabilmente sono in un certo grado di equilibrio energetico negativo) rispetto a quelle vacche che sono state appena nutrite (la lipolisi sarà inibita in queste ultime vacche). Si raccomanda il prelievo appena prima dell’alimentazione.

Interpretazione del test

Il testNEFA viene effettuato per lo più nei bovini da latte per determinare se la mandria è in eccessivo bilancio energetico negativo. Viene utilizzato più come test a livello di mandria che di singolo animale e i risultati vengono interpretati in relazione a una concentrazione di cut-off o alla percentuale di animali con valori superiori al cut-off rispetto ai valori superiori al limite superiore di riferimento. La misurazione del NEFA può essere effettuata in qualsiasi altra specie come marker di un eccessivo bilancio energetico negativo. Questo viene fatto più frequentemente nei camelidi (che sviluppano una lipidosi epatica in queste circostanze), in altri ruminanti (per esempio capre, pecore) per determinare se sono a rischio di chetosi, e nei cavalli (con la sindrome metabolica equina). Si noti che le concentrazioni sotto il limite di riferimento non sono clinicamente rilevanti.

Concentrazioni aumentate

• Fisiologico: L’esercizio fisico induce il rilascio di catecolamine e ACTH, che stimola l’attività idrolitica della lipasi ormono-sensibile per promuovere la mobilitazione del grasso al fine di soddisfare le richieste di energia in eccesso. Questo processo aumenta la concentrazione di NEFA nel sangue.
• Differenze di razza: Diversi studi hanno dimostrato che i NEFA sono più bassi nelle vacche Jersey dopo il parto rispetto alle vacche Holstein, quindi le linee guida sviluppate per le vacche Holstein (vedi sotto) potrebbero non essere applicabili alle Jersey (Rastani et al 2001, French 2006, Guretsky et al 2006, Brown et al 2012).
• Bilancio energetico negativo nelle vacche da latte: Le vacche da latte nel periodo peripartum (transizione) sono sempre in uno stato di bilancio energetico negativo a causa delle elevate richieste di energia dal feto in via di sviluppo e dalla produzione di latte (in particolare con l’enfasi sulla selezione per alti produttori di latte). Tuttavia, questo stato di bilancio energetico negativo può essere eccessivo e le vacche colpite sono a rischio di malattie gastrointestinali (abomaso spostato), metaboliche (chetosi clinica) e infettive (es. metrite) nel primo periodo postpartum. Pertanto, i professionisti del settore lattiero-caseario monitorano frequentemente le mandrie per l’eccesso di bilancio energetico negativo mediante test per i NEFA, sia da soli nelle vacche pre- o post-partum, sia come componente di un profilo metabolico nelle vacche post-partum. I risultati di questi test possono essere interpretati a livello di singola vacca (cioè un valore NEFA al di sopra di un certo cut-off indica un eccesso di bilancio energetico negativo) o a livello di mandria (cioè una proporzione di vacche testate ha valori NEFA superiori a un certo valore di cut-off). L’identificazione di un eccesso di bilancio energetico negativo nelle singole vacche (e soprattutto) nella mandria indica la necessità di cambiamenti nella nutrizione (ad esempio, aumento dello spazio di alimentazione a castello, aumento della densità energetica della razione) e nella gestione delle vacche in transizione per diminuire le richieste di energia e lo stress sulle vacche in transizione. Le seguenti linee guida di interpretazione si basano su studi condotti presso la Cornell University e sono valide per campioni raccolti da vacche Holstein alimentate con TMR “a rischio” tra 2-14 giorni prima del parto (NEFA prepartum) o 3-14 giorni dopo il parto (NEFA postpartum). Si raccomanda di campionare almeno 12 vacche “a rischio” quando si valutano gli allevamenti alimentati con razione mista totale (TMR) per la chetosi subclinica (Ospina et al 2013).
  • Test a livello della vacca
    • NEFA prepartum: C’è un’aumentata incidenza di malattie post parto (abomaso spostato, metrite/placenta trattenuta e chetosi clinica), diminuzione della produzione di latte e diminuzione delle prestazioni riproduttive nei primi 30 giorni di latte nelle vacche da latte Holstein (alimentate con TMR) con valori di NEFA > 0,30 mEq/L quando testati 2-14 giorni prima del parto.
    • NEFA post-parto: C’è una maggiore incidenza di malattie post parto (abomaso spostato, metrite/placenta trattenuta e chetosi clinica), diminuzione della produzione di latte e diminuzione delle prestazioni riproduttive nei primi 30 giorni di latte nelle vacche da latte Holstein (alimentate con TMR) con valori di NEFA > 0.60-0.70 mEq/L quando testati 3-14 giorni dopo il parto. Negli studi della Cornell, i NEFA post parto erano in realtà un miglior predittore delle concentrazioni di β-idrossibutirrato post parto o dei NEFA pre parto.
  • Test a livello di mandria
    • NEFA prepartum: A livello di mandria, c’è un rischio significativamente aumentato di malattie metaboliche e infettive dopo il parto, diminuzione della produzione di latte o diminuzione delle prestazioni riproduttive se >15% delle vacche pre parto testate hanno valori NEFA > 0.30 mEq/L. Si noti che, come indicato sopra, il raggruppamento di campioni da singole vacche non è raccomandato per i test a livello di mandria.
    • NEFA post-parto: A livello di mandria, c’è un rischio significativamente aumentato di malattie metaboliche e infettive post parto, diminuzione della produzione di latte o diminuzione delle prestazioni riproduttive se >15-20% delle vacche post parto testate hanno valori NEFA > 0,70 mEq/L. Si noti che, come indicato sopra, il raggruppamento di campioni da singole vacche non è raccomandato per i test a livello di mandria.
• Lipidosi epatica nei bovini da latte: In uno studio, un rapporto NEFA:colesterolo >0,2 (unità SI) aveva un odds ratio di 9,9 per un animale con lipidosi epatica (definita come >10% di contenuto lipidico nel fegato), con questo cut-off più sensibile (63% con 85% di specificità) rispetto a BHB, NEFA da solo o attività AST (>120 U/L) per la diagnosi di lipidosi epatica (basata sull’area sotto la curva caratteristica operativa del ricevitore o AUC). Tuttavia, gli animali in questo studio avevano misurazioni del sangue effettuate in vari momenti dopo l’allattamento (Mostafavi et al 2013).
• Bilancio energetico negativo nei piccoli animali: Questo si verifica principalmente nel diabete mellito. In uno stato di carenza di insulina o di resistenza all’insulina si perde l’inibizione della lipasi ormono-sensibile. Uno squilibrio normativo dell’attività della lipasi ormono-sensibile aumenta la mobilitazione del grasso dal tessuto adiposo al tessuto epatico, elevando la concentrazione di NEFA.
• Bilancio energetico negativo nei camelidi: I camelidi malati e stressati, in particolare le femmine gravide, sono a rischio di sviluppare una lipidosi epatica. La misurazione del NEFA può essere fatta per determinare se sono in equilibrio energetico negativo. I cammelli con NEFA > 0.8 mEq/L (Tornquist et al 2001) sono a maggior rischio di lipidosi. I camelidi anoressici hanno spesso NEFA aumentati ma al di sotto di questo valore e possono non sviluppare lipidosi.