Morpholino oligos sono strumenti avanzati per bloccare siti su RNA per ostacolare i processi cellulari. Un oligo morfolino si lega specificamente al suo sito bersaglio selezionato per bloccare l’accesso dei componenti cellulari a quel sito bersaglio. Questa proprietà può essere sfruttata per bloccare la traduzione, bloccare lo splicing, bloccare i miRNA o i loro obiettivi e bloccare l’attività dei ribozimi.
Blocco della traduzione: Bloccando stericamente il complesso di iniziazione della traduzione, le morfoline possono abbattere l’espressione di molte sequenze bersaglio in modo abbastanza completo che, dopo aver atteso la degradazione della proteina esistente, la banda della proteina bersaglio scompare dai Western blot. A differenza di molti tipi di antisenso (ad esempio siRNA, fosforotioati), le morfoline generalmente non causano la degradazione dei loro obiettivi RNA; invece, bloccano l’attività biologica dell’RNA bersaglio fino a quando l’RNA viene degradato naturalmente, che rilascia il morfolino. Questo significa che la RT-PCR non è adatta per valutare il blocco della traduzione da parte dei morfolini.
Blocco della splicatura: Bloccando i siti coinvolti nello splicing del pre-mRNA, i morfolini possono essere usati per modificare e controllare i normali eventi di splicing. Questa attività può essere convenientemente valutata da RT-PCR, con successo splice-modificazione che appare come cambiamenti nella banda prodotto RT-PCR su un gel elettroforetico. La banda potrebbe spostarsi su una nuova massa o, se la modificazione della scissione innesca il decadimento nonsense-mediato della trascrizione, la banda wild-spliced perderà intensità o scomparirà.
Come tutti i reagenti di abbattimento del gene, Morpholinos deve essere attivamente consegnato nella maggior parte delle cellule. Morpholinos può essere consegnato in cellule coltivate da una varietà di metodi, tra cui scrape-loading di cellule aderenti, elettroporazione, e anche microiniezione. Tuttavia, il nostro reagente di consegna Endo-Porter dà generalmente consegna eccellente in cellule coltivate in termini di quantità di Morpholino consegnato per cella, anche la distribuzione in una popolazione di cellule, riproducibilità di consegna e non tossicità per la maggior parte dei tipi di cellule alla concentrazione raccomandata. Per gli esperimenti sugli animali i nostri Vivo-Morpholinos con la loro moiety di consegna allegata entrano nelle cellule dal sangue dopo la somministrazione i.v. o entrano nelle cellule nei tessuti che circondano le iniezioni locali; sono anche gli oligo antisenso più conveniente per l’uso in culture cellulari o espianti, in quanto non richiedono alcun agente aggiuntivo per la consegna citosolica.
Un oligo morfolino è radicalmente diverso dagli acidi nucleici naturali, con anelli di metilenemorfolina che sostituiscono le moieties di zucchero ribosio o desossiribosio e legami fosforodiamidati non ionici che sostituiscono i fosfati anionici di DNA e RNA. Ogni anello di morfolina posiziona adeguatamente una delle basi standard del DNA (A, C, G, T) per l’accoppiamento, in modo che un oligo Morpholino a 25 basi si leghi fortemente e specificamente al suo sito bersaglio complementare a 25 basi in un filamento di RNA tramite l’accoppiamento Watson-Crick. Poiché la spina dorsale non carica dell’oligo Morpholino non è riconosciuta dagli enzimi, è completamente stabile alle nucleasi.
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- Valutare la consegna
- Solubilità e Morpholinos
Come per tutti gli agenti di abbattimento genico, la consegna efficace delle morfoline è fondamentale. Mentre la conferma della consegna non è cruciale per gli esperimenti che utilizzano la microiniezione embrionale, la conferma della consegna è importante per gli esperimenti con cellule coltivate. Il nostro reagente di consegna Endo-Porter generalmente dà consegna semplice e affidabile per la maggior parte dei tipi di cellule. È possibile valutare se si sta ottenendo una buona consegna nel citosol delle vostre cellule utilizzando un fluorescente-tagged Morpholino. Si consiglia di utilizzare il nostro economico fluoresceina-tagged Standard Control oligo per questo scopo.
Quando si utilizza un Morpholino fluorescente per confermare la consegna, iniziare con una concentrazione di 10 microMolar Morpholino oligo nel terreno di coltura. Questa è una concentrazione abbastanza alta che dopo 16 ore il Morpholino marcato con la fluorescenza dovrebbe essere visibile nel citosol con la microscopia a fluorescenza. Un microscopio a fluorescenza invertito è la scelta migliore per osservare le cellule nelle piastre di coltura. Osservare le cellule vive (non fissate). Usare un obiettivo asciutto con la massima apertura numerica disponibile per raccogliere quanta più luce possibile dalle cellule. Il successo della somministrazione si manifesta con una fluorescenza diffusa in tutto il citosol. Fluorescenza punctate di solito indica che l’oligo è intrappolato in endosomi, in modo da ignorare le macchie punctate e cercare la fluorescenza diffusa.
Per gli esperimenti reali consegnare il vostro Morpholino sequenza personalizzata con Endo-Porter è generalmente necessario una concentrazione di solo 1 a 5 microMolar per un efficace blocco sterico della maggior parte degli mRNA.
Anche se gli oligo Morpholino sono molto più solubili di altri tipi strutturali non ionici (come i PNA), alcuni Morpholinos con alto contenuto di G (>30%) hanno una solubilità limitata. Inoltre, l’attaccamento della nostra lissamina fluor che emette rosso a volte diminuisce la solubilità dell’oligo. La solubilità varia con la sequenza dell’oligo ed è difficile da prevedere. Le raccomandazioni di seguito possono aiutare a mantenere l’attività oligo se la sequenza ha scarsa solubilità.
Per la conservazione a lungo termine le soluzioni stock Morpholino sono meglio conservati liofilizzati, Il prossimo-migliore scelta è la conservazione in soluzione a temperatura ambiente. Rendere le soluzioni stock di Morpholino a o sotto 1 milliMolar aiuta ad evitare problemi di solubilità. Cicli di congelamento-disgelo o stoccaggio a lungo termine a 4C può causare la precipitazione o associazione contenitore di Morpholinos e diminuire l’attività della soluzione; si consiglia di temperatura ambiente di stoccaggio in contenitori ermeticamente sigillati e, per evitare l’evaporazione in caso di un sigillo difettoso fiala, è prudente per conservare le scorte in un ambiente umido come un humidor (ad esempio una campana vaso con un bicchiere aperto di acqua). Fare attenzione a non far seccare l’oligo, poiché può essere difficile o impossibile sciogliere nuovamente un oligo essiccato (anche se gli oligo liofilizzati si sciolgono abbastanza facilmente). Tenere la fiala in una scatola buia o avvolta in un foglio di alluminio è una buona pratica, in quanto gli oligo marcati con il fluoro possono fotodegradarsi alla luce.
L’aggregazione in soluzione può causare una diminuzione dell’attività biologica nel tempo e questo può avvenire in soluzioni conservate a temperatura ambiente. Questo può essere invertito in alcuni casi riscaldando 5 minuti a 65C o nella maggior parte dei casi sterilizzando in autoclave (usare il ciclo liquido). Gli oligo sono molto stabili al calore e possono tollerare diversi cicli di sterilizzazione in autoclave senza degradazione. Spesso l’autoclavaggio farà rivivere uno stock che ha perso un po’ di attività a causa dell’aggregazione dell’oligo.
DNA, RNA e la maggior parte dei reagenti per il knockdown genico sono tipicamente conservati in un bagno di ghiaccio durante gli esperimenti per minimizzare la degradazione da parte delle nucleasi. Poiché le Morpholinos sono completamente resistenti alla degradazione enzimatica e le soluzioni acquose sono chimicamente stabili a tempo indeterminato (anni) a temperatura ambiente, si raccomanda che durante i tuoi esperimenti tu mantenga le tue soluzioni stock di Morpholinos a temperatura ambiente. Raffreddare le tue soluzioni stock in un bagno di ghiaccio rischia semplicemente di far precipitare il Morpholino.
Queste precauzioni sono più che necessarie per la maggior parte delle sequenze, ma il loro uso di routine aiuta ad evitare spiacevoli sorprese nel caso in cui si incontra una sequenza con bassa solubilità.