Introduzione

4-idrossi-l-prolina (idrossiprolina) è un aminoacido an-proteinogenico, che ha un peso molecolare di 131.13g/mol ed è sintetizzato dall’idrossilazione post-traslazionale della prolina durante la biosintesi del collagene (Fig. 1). Le indagini sul metabolismo fisiologico e patologico del collagene utilizzano più comunemente misure di idrossiprolina nel plasma, nelle urine e nel tessuto corporeo. Pertanto, la determinazione dell’idrossiprolina fornisce informazioni utili per la diagnosi e la prognosi delle malattie causate da disturbi del metabolismo del collagene (1). Tali condizioni includono ipertiroidismo, iperparatiroidismo, acromegalia, malattia di Paget, osteomalacia, rachitismo, sindrome di Marfan, osteogenesi imperfetta, sclerodattilia, dermatomiosite e sindrome di Cushing (2).

La fibrosi che si verifica nel fegato, nei polmoni, nei reni, nella pelle e in altri organi ha la capacità di svilupparsi in epatite cronica, sclerosi epatica, cancro al fegato, fibrosi polmonare e glomerulonefrite (3). Pertanto, prevenire lo sviluppo e ridurre la gravità della fibrosi nei pazienti è molto importante. L’idrossiprolina agisce come un importante indicatore diagnostico della gravità della fibrosi.

La misurazione dell’idrossiprolina nel plasma, nelle urine e nel tessuto corporeo è possibile con metodi colorimetrici, cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) e flow injectionanalyses (4-6). Tuttavia, questi metodi richiedono grandi volumi di campioni, a causa della loro bassa sensibilità. Inoltre, HPLC richiede un lungo tempo di separazione per ogni campione. Negli ultimi anni, cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC-MS) è stato emergingas vantaggioso per la sua alta sensibilità e breve tempo di separazione.LC-MS è stato utilizzato per misurare basse concentrazioni di droga inserum e urina con sostanze contaminate (7-9). Il presente studio ha mirato ad applicare il nuovo metodo LC-MS per la misurazione tema di idrossiprolina. Come indicatore di fibrosi, idrossiprolina nel fegato e polmone di un modello di ratto di fibrosi è stato misurato da LC-MS, e confrontato con i risultati precedenti ottenuti daHPLC e metodi colorimetrici.

Materiali e metodi

Dichiarazione etica

Il protocollo di studio è stato approvato dal comitato etico di Harbin Medical University (Harbin, Cina). Una procedura standard per ottenere il consenso informato scritto è stato incluso nel protocollo, ed è stato approvato dal comitato etico di Harbin Medical University.

Reagenti

Dimetilnitrosamina (DMN) e idrossiprolina sono stati ottenuti da Nacalai Tesque Inc. (Kyoto, Giappone). Il Nembutal è stato acquistato da Dai-Nihon Pharmaceuticals Inc. (Osaka, Giappone) e lableomicina è stata ottenuta dalla Nihon Kayaku Inc. (Tokyo, Giappone). Tutti gli altri prodotti chimici erano di grado reagente.

Preparazione di un modello di fibrosi polmonare e fegato nei ratti

Un modello di fibrosi polmonare è stato creato in cinque settimane di ratti Wistar mediante iniezione di bleomicina (BLM, 0.30U/100 g, i.p.) nella trachea sotto anestesia nembutal (50 mg/kg). ratti sani sono stati iniettati con 0,9% di soluzione salina (controllo).

Un modello di fibrosi epatica è stato creato in ratti Wistar di sette settimane con una singola iniezione di DMN (40 mg/kg, i.p.). I ratti sani normali erano i controlli e sono stati iniettati con 0,9% di soluzione salina (controllo). La preparazione del modello di fibrosi epatica polmonare e del tessuto di raccolta erano basati su themethods descritto negli studi precedenti (10,11).

Misurazione di idrossiprolina in un modello di ratto di fibrosi polmonare con un metodo colorimetrico

Il polmone sinistro è stato rimosso, pesato (~0.3 g) andhomogenized in soluzione di acido tricloroacetico 5% (volume x10) usinga cell homogenizer (Eilard, Berlino, Germania) a 8.000 × g (4 ° C) for2 min in un bagno di ghiaccio. Le cellule sono state centrifugate (2.500 × g, 4°C) per 20 minuti e il surnatante è stato lavato due volte con acqua distillata. Poi, 6 N HCl è stato aggiunto a 110 ° C completamente all’inizio e ha reagito per 16 ore. Dopo il completamento della reazione, toluene (3 ml) è stato aggiunto e la miscela è stata agitata per 20 min. Dopo la centrifugazione (3.000 × g, 20°C) per 10 min, lo strato organico è stato raccolto e la p-dimetilamminobenzaldeide è stata aggiunta.L’idrossiprolina nel campione è stata rilevata utilizzando un MultiplateSpectrometer (Ultramark; Bio-Rad, Hercules, CA, USA) a 560 nm.

Misurazione di idrossiprolina nel fegato da HPLC

Il polmone sinistro è stato rimosso, pesato (~ 0,3 g) andhomogenized in 5 ml di etanolo utilizzando un omogeneizzatore cellulare (Eilard) at8,000 × g (4 ° C) per 2 min in un bagno di ghiaccio. L’omogeneizzato è stato centrifugato (2.500 × g, 4°C) per 20 minuti e il surnatante è stato raccolto. Il liquido (1 ml) è stato ottenuto e riscaldato per 8 h a60°C fino a secco. Dopo aver sciolto il residuo in 40 μl etanolo e 80 μl di tampone borato (0,1 M, pH 8), 40 μl4-fluoro-7-nitrobenzofurazan (100 mM) è stato aggiunto come fluorescencereagent. La reazione è stata lasciata continuare a temperatura ambiente per 15 ore al buio. Poi, 840 μl di acido cloridrico (6 mol/l) è stato aggiunto per terminare la reazione. Dopo la centrifugazione (2.500 × g, 20°C) per 20 minuti, il surnatante è stato rimosso per l’analisi HPLC.

È stato utilizzato un sistema HPLC Hitachi L6000 (Hitachi HighTechnologies America, Inc., Schaumburg, IL, USA) e la rilevazione è stata effettuata con uno spettrometro a fluorescenza Hitachi L7480 (Hitachi High-Technologies Corporation, Tokyo, Giappone; eccitazione a 475 nm, emissione a 530 nm). La colonna (HitachiHigh-Technologies Corporation) era una YMC Pack ODS-AQ (150×6.0 mmID) a temperatura ambiente. La fase mobile era acetonitrile: acqua (35:65-50:50 gradiente su 15 min) e la velocità di flusso era 1ml/min.

Misurazione di idrossiprolina inpolmonare e organizzazione epatica da LC-MS

Il polmone sinistro è stato rimosso, pesato (~0.3 g) andhomogenized in soluzione di acido tricloroacetico 5% (volume x10) usinga cell homogenizer (Eilard) a 8.000 × g (4 ° C) per 2 min in un bagno di ghiaccio. Le cellule sono state centrifugate (2.500 × g, 4°C) per 20 minuti. Il surnatante è stato lavato due volte con acqua distillata. Poi, 6 N HCl è stato aggiunto a 110°C per 16 ore e i campioni sono stati preparati per la misurazione. Il fegato è stato rimosso, pesato (~0,3 g) e omogeneizzato in 5 ml di etanolo utilizzando un omogeneizzatore cellulare (Eilard) a 8.000 × g (4°C) per 2 minuti in un bagno di ghiaccio. L’omogeneizzato è stato centrifugato (2.500 × g, 4°C) per 20 min, il surnatante raccolto e i campioni preparati per la misurazione.

La concentrazione di idrossiprolina è stata determinata seguendo un metodo LC-MS utilizzando un sistema LC-MS2020 (Shimadzu Corp., Kyoto, Giappone). Per quanto riguarda la LC, la fase mobile era 5%CH3CN-10 mM CH3COONH4. La colonna era Shin-pack VP-ODS (150×2 mm di diametro). La velocità di flusso era di 0,2 ml/min. Per quanto riguarda la MS, è stata impiegata la ionizzazione chimica atmosferica (APCI). È stata utilizzata anche la rilevazione degli ioni positivi. La tensione dell’elettrone della sonda era di 4,5 kV e la corrente della sonda era di 4,2 μA. La temperatura della sonda APCI era di 250°C e la tensione dell’elettrone della linea curva di desolvation (CDL) era di -30,0 V. La temperatura CDL era 250°C e la temperatura del blocco 20°C. La tensione di polarizzazione per Q-array 1, 2 e 3 erano 5.0, 25.0 e 35.0 V, rispettivamente. Il Q-array RF electronvoltage era 150.0 V.

Analisi statistica

Le differenze tra i gruppi sono state esaminate dall’analisi della varianza a senso unico. Se una differenza significativa è stata notata, la differenza tra i gruppi è stata esaminata con il metodo Bonferroni. Le correlazioni sono state esaminate usando un test a due lati. P<0.05 è stato considerato per indicare una differenza statisticamente significativa.

Risultati

Misurazione della concentrazione di idrossiprolina tramite LC-MS

Cromatogramma MS di idrossiprolina

Lo spettro di massa di idrossiprolina è mostrato inFig. 2. MS dell’idrossiprolina standard (80 pg/ml) ha dato luogo a picchi di frammenti con una massa molecolare di 173.0 (ione molecolare + acido acetico-acqua) generati dall’aggiunta all’ammonio dell’acido acetico per aumentare il numero di molecole ioniche (quantità molecolare, 131.15) e la forza ionica.

CromatogrammaLC-MS dell’idrossiprolina

Le condizioni LC erano le seguenti: Fase mobile, 5%CH3CN-10 mM CH3COONH4; colonna, Shin-pack VP-ODS (150×2 mm di diametro); velocità di flusso, 0,2 ml/min e rilevamento ultravioletto (UV) a 230 nm. MS è stata eseguita utilizzando il metodo di ionizzazioneAPCI e la rilevazione dello ione era positivo.

La LC-MS-selected ion monitoring (SIM) chromatogramof hydroxyproline (m/z, 173.0) è presentato in Fig 3. Come osservato per l’idrossiprolina standard, è stato osservato un picco a 1 ng/ml a un tempo di ritenzione di 2,213 min. Un picco netto è stato osservato anche a 50 ng/ml. A 1 μg/ml, che era 1.000 × la concentrazione standard, un piccolo picco è stato notato nello spettro LC-UV (230 nm).

Sensibilità del rilevamento LC-MS ahydroxyproline

La LC-MS-SIM curva standard di hydroxyproline (m/z, 173,0; ione molecolare + acido acetico-acqua) è mostrato inFig. 4. Utilizzando l’area di picco methodfor la curva standard, idrossiprolina esposto un picco forte a 35ng / ml (Fig. 3). Tuttavia, alle concentrazioni <35 ng/ml, una correlazione tra le aree di picco non è stata osservata. Da 35-560 ng/ml, è stata osservata una correlazione tra le aree di picco e la curva standard era una linea retta. A 60 e 80 μg/ml, le aree dei picchi erano quasi identiche. Una correlazione tra le aree dei picchi non è stata osservata a concentrazioni >60 μg/ml.

Cromatogramma LC-MS e spettro MS dell’idrossiprolina in un modello di fibrosi polmonare ed epatica nei ratti

Fig. 5 mostra il cromatogramma LC-MS e lo spettro MS con rilevazione SIM dell’idrossiprolina (m/z 173.0; ione molecolare + acido acetico-acqua) in un modello polmonare di fibrosi nei ratti. Nel LC-MSchromatogramma del polmone, simile a quello del hydroxyprolinestandard, un picco distinto a m/z 173.0 è stato osservato a aretention time di 2,213 min. Hydroxyproline è stato identificato atm/z 131.15 nello spettro di massa.

Fig. 6 illustratesthe LC-MS cromatogramma e spettro MS con rilevamento SIM ofhydroxyproline (m/z 173.0; ione molecolare + aceticacid-acqua) nel tessuto epatico fibrotico di ratti. Come osservato per lo standard idrossiprolina, un picco è stato notato ad un timeof ritenzione 2.213 min nel LC-MS cromatogramma e MS spectrum.

Hydroxyproline concentrazione in lungtissue (metodi colorimetrici e LC-MS)

Colorimetric e LC-MS metodi impiegati per thedetermination della concentrazione di idrossiprolina in rat lungtissue sono confrontati in Fig. 7.Each colonna rappresenta la media ± deviazione standard di noveexperiments. Secondo il metodo colorimetrico, la concentrazione di idrossiprolina nel tessuto polmonare di ratto nel BLM-infuso gruppo (652.3±70.0 μg / polmone sinistro) era significativamente più alto rispetto a quello del gruppo di controllo (547.1±52.3 μg / polmone sinistro; P<0.05). Secondo il metodo LC-MS, il gruppo infuso con BLM (610,9±50,3 μg/polmone sinistro) aveva un valore significativamente più alto rispetto al gruppo di controllo (493,3±53,5 μg/polmone sinistro; P<0,05).Tuttavia, la concentrazione di idrossiprolina nel tessuto polmonare di ratto misurata con il metodo LC-MS aveva un valore inferiore rispetto a quella misurata con il metodo colorimetrico.

Le concentrazioni di idrossiprolina nel tessuto polmonare di ratto misurate con i metodi colorimetrico e LC-MS sono confrontate in Fig. 8. È stata identificata una correlazione tra i metodi colorimetrico e LC-MS per la determinazione della concentrazione di idrossiprolina nel tessuto polmonare del gruppo di controllo (r=0,972). Allo stesso modo, è stata identificata una correlazione tra i metodi colorimetrico e LC-MS per la determinazione della concentrazione di idrossiprolina nel tessuto polmonare del gruppo infuso con BLM (r=0,918).

Concentrazione di idrossiprolina nel tessuto epatico di ratto mediante etichettatura a fluorescenza e metodi LC-MS

La valutazione della concentrazione di idrossiprolina nel tessuto epatico di ratto mediante etichettatura a fluorescenza e metodi LC-MS è illustrata nella figura 9. Secondo il metodo di etichettatura a fluorescenza, la concentrazione di idrossiprolina nel tessuto epatico di ratto del gruppo infuso con DMN (105,4±36,5 μg/g) era significativamente più alta rispetto a quella del gruppo di controllo (30,3±2,7 μg/g; P<0,05). Anche secondo l’analisiLC-MS, il gruppo infuso con DMN (190,4±70,3 μg/g) ha dimostrato un valore significativamente più alto rispetto al gruppo di controllo (62,4±6,8 μg/g; P<0,05). Tuttavia, la concentrazione di idrossiprolina nel tessuto epatico di ratto misurata da LC-MS era più alta rispetto a quella misurata con il metodo di etichettatura a fluorescenza.

La concentrazione di idrossiprolina nel tessuto epatico di ratto valutata con i metodi di etichettatura a fluorescenza e LC-MS sono correlati in Fig. 10. La concentrazione di idrossiprolina nel tessuto epatico del gruppo di controllo valutato mediante etichettatura a fluorescenza era correlata a quella ottenuta con il metodo LC-MS (r=0,957). Inoltre, la concentrazione di idrossiprolina nel tessuto epatico del gruppo infuso di DMN ottenuta con il metodo di etichettatura a fluorescenza era correlata a quella ottenuta con il metodo LC-MS (r=0,981).

Discussione

L’idrossiprolina è un tipo di aminoacido presente nell’albumina. Il residuo di prolina nella proteina è idrossilato dalla 4-monoossigenasi per generare acido 4-idrossi-2-ossoglutale, che viene convertito in alanina e glicina attraverso l’acido 4-glutammico nel corpo umano. In ogni organo interno del corpo, l’infiammazione e la fibrosi possono dar luogo all’accumulo di componenti della matrice extracellulare (ECM) (12). Tuttavia, in condizioni patologiche, può verificarsi un’ulteriore fibrosi nel fegato, nei polmoni e nei reni (13,14).L’epatite cronica e la sclerosi epatica sono associate alla fibrosi e hanno anche una stretta correlazione con il cancro del fegato (15).

Nei polmoni, la gravità della fibrosi dipende dal tipo di polmonite (16).Di solito, la fibrosi polmonare accompagna la polmonite interstiziale (17). La fibrosi negli organi interni è causata dalla proliferazione dei componenti ECM depositati dai miofibroblasti. Comprendere lo sviluppo della fibrosi implica l’esame della concentrazione di collagene. La concentrazione di idrossiprolina è associata al collagene come indicatore della gravità della fibrosi (18-20). L’idrossiprolina è importante come indice della malattia causata dalla proliferazione del collagene (come infibrosi) e malfunzionamento del metabolismo.

Negli ultimi anni, LC-MS ha dimostrato di essere un metodo di rilevamento altamente sensibile (7,8,21).LC-MS comprende una componente LC e MS, e l’interfaccia che li collega. La parte LC è identica all’HPLC convenzionale. Il campione viene ionizzato dalla sezione dell’interfaccia. La ionizzazione a termospray produceva prodotti instabili (volatili), per cui veniva utilizzato l’APCI (che ionizza il materiale, ma non il solvente, dopo la nebulizzazione con solvente a pressione atmosferica). La ionizzazione Electrospray (ESI) può essere utilizzata per ionizzare molecole di alta polarità e alto peso molecolare, che è idealmente adatto al componente dell’interfaccia.Tuttavia, nel presente studio, ESI non è stato adattato alla misurazione tema di idrossiprolina in campioni del corpo, come ESI non era notaccompagnato dal thermospray in caso di ionizzazione. Era una procedura più semplice per misurare l’idrossiprolina combinata con Na+ aggiungendo ulteriori Na+ al campione.

Lo spettro MS dell’idrossiprolina ha dimostrato picchi di m/z 173.0 e 131.15. m/z 173.0 è stato identificato come il picco che rappresenta il sale di acido acetico proveniente dall’ammonio di acido acetico che è stato aggiunto alla fase mobile per aumentare la forza ionica. Inoltre, a causa della forza comparativa di m/z 131.15 e 173.0 che è approssimativamente identica nello spettro MS, lo ione di m/z 173.0 è stato scelto da SIM nel MSchromatogramma per evitare il picco di interferenza della fase mobile.

Nel cromatogramma MS dell’idrossiprolina standard a 1 ng/ml, un picco è stato osservato nel measurementwith SIM m/z 173.0. Nello spettro UV (230 nm) dell’idrossiprolina a 1 μg/ml, che era 1.000× la concentrazione standard, è stato osservato un piccolo picco (la misurazione è stata eseguita contemporaneamente alla misurazione LC).

A concentrazioni <35 ng/ml, tra le aree di picco, non è stata osservata una forte correlazione tra i diversi metodi e non è stato possibile creare una curva standard. Si è ipotizzato che l’analita possa essere stato influenzato dal picco della fase mobile, poiché l’idrossiprolina ha un peso molecolare relativamente basso (131,15). Inoltre, il tempo di ritenzione del picco potrebbe essere diventato instabile a causa della polarità del solvente a basse concentrazioni (concentrazione di idrossiprolina <35 ng/ml).

Si è ipotizzato che sia possibile misurare concentrazioni di sostanze basse come il livello pg/ml. Per il picco dell’idrossiprolina nel cromatogramma MS, il tempo di ritenzione era breve (2,213 min). La capacità dell’idrossiprolina di bemaintained sulla colonna ODS era più debole di quanto originariamente proposto.La forza ionica relativa nello spettro MS a m/z 131.15e 173.0 era approssimativamente identica, e di conseguenza, il picco di interferenza della fase mobile ha scelto uno ione di m/z173.0. Nel cromatogramma LC-MS di idrossiprolina nel tessuto polmonare e fegato, un picco acuto di m/z 173.0 è stato osservato a aretention time di 2.213 min, proprio come per l’idrossiprolina standard. Per quanto riguarda lo spettro MS, il picco di ioni molecolari dell’idrossiprolina (m/z 131.15) è stato confermato.

La misurazione della concentrazione di idrossiprolina nei tessuti del polmone e del fegato mediante LC-MS è stata confrontata con quella ottenuta con il metodo colorimetrico e con un metodo a fluorescenza mediante HPLC da uno studio precedente del nostro gruppo. È stata notata una correlazione positiva altamente significativa. Tuttavia, il valore della concentrazione di idrossiprolina nel polmone ottenuto con il metodo colorimetrico è più alto di quello ottenuto con LC-MS. Inoltre, la concentrazione di idrossiprolina nel fegato ottenuta con il metodo della fluorescenza tramite HPLC era inferiore rispetto al valore ottenuto tramite LC-MS (che doveva essere un’alta assorbanza di tutti i componenti nel campione ad una lunghezza d’onda costante di 560 nm).

In conclusione, l’idrossiprolina, come indicatore di ibrosi, è stata misurata con metodi colorimetrici e HPLC in studi precedenti del nostro gruppo. Per confronto, il presente studio ha identificato che il metodo LC-MS era più vantaggioso, caratterizzato da un processo semplice, alta sensibilità (livello pg) e breve tempo di separazione. Ulteriori indagini con dimensioni del campione più grandi sono garantiti per confermare questi risultati.

Riconoscimenti

Gli autori sono grati a M. Kusunose, M. Ono andA. Hamada (Dipartimento di Farmacia, Kochi Medical School, Kochi, Giappone) per aver fornito diversi reagenti utilizzati in questo studio, suggerimenti utili e competenze tecniche. Questo lavoro è stato finanziato dal Dipartimento di salute pubblica della provincia di Heilongjiang (no. 2013365) ofChina.

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