2.1 Migrazione e interazioni delle cellule B in sviluppo

Durante la linfopoiesi, le cellule B nel midollo osseo passano attraverso una sequenza ben caratterizzata di vari stadi di sviluppo. Le cellule B in via di sviluppo dipendono criticamente da segnali specifici per la loro sopravvivenza e differenziazione, che vengono forniti loro in varie nicchie microambientali definite dalle cellule stromali. Si ritiene che le cellule B migrino tra queste aree tissutali durante il loro sviluppo. Il concetto di nicchie microambientali fisse che sono necessarie per ospitare le cellule e controllare il loro destino è stato proposto per la prima volta negli anni ’70 da Schofield et al. nel contesto delle cellule staminali. Si ritiene che le cellule staminali ematopoietiche (HSC) siano circondate da un microambiente unico che controlla il loro destino in termini di divisione, sopravvivenza e differenziazione. Da allora, è stato dimostrato che concetti simili si applicano a diversi tipi di cellule ematopoietiche e stadi di differenziazione, compresi i linfociti B in via di sviluppo e persino le plasmacellule della memoria nel midollo osseo.

I precursori delle cellule B nel midollo osseo sono generati da CSE multipotenti, che persistono per tutta la vita di un individuo e sono caratterizzate dal loro potenziale di auto-rinnovamento, una caratteristica che dipende da fattori intrinseci ed estrinseci. Fino a poco tempo fa, non era chiaro se le CSE e i progenitori ematopoietici ristretti (HPC) risiedessero in nicchie microambientali specializzate e spazialmente distinte l’una dall’altra, e in letteratura si è evoluta una dicotomia tra nicchie osteoblastiche da un lato e nicchie di cellule staminali vascolari dall’altro. Le HSC sono state descritte per localizzarsi nelle vicinanze degli osteoblasti, che sono cellule che formano l’osso e rivestono il confine tra l’osso solido e il midollo. Gli osteoblasti hanno una funzione cruciale nel regolare il mantenimento del pool di cellule staminali – un aumento del numero di osteoblasti trabecolari N-caderina + è concomitante con un numero elevato di HSC. Questo effetto è mediato dall’attivazione del percorso Notch1, innescato da Jagged1 derivato dagli osteoblasti, che porta alla proliferazione delle CSE. Gli osteoblasti secernono anche altri fattori che regolano l’omeostasi delle CSE, come la trombopoietina, l’angiopoietina e la chemochina C-X-C-motif ligand-12 (CXCL12). Tuttavia, le cellule endoteliali, che spesso si localizzano vicino all’endostio, soprattutto nelle ossa piatte, hanno dimostrato di costituire un altro componente cruciale della nicchia HSC. Insieme alle cellule perivascolari con recettore della leptina, le cellule endoteliali forniscono il fattore delle cellule staminali (SCF, noto anche come ligando kit) all’interno della nicchia vascolare, e la sua delezione condizionale da queste cellule risulta in una deplezione delle CSE dal midollo osseo.

CXCL12, che è anche chiamato “stromal cell derived factor one alpha” a causa della sua elevata espressione da parte dei componenti stromali, è una chemochina cruciale per regolare la localizzazione e la migrazione delle CSE nel midollo osseo attraverso il suo recettore, C-X-C-motif receptor-4 (CXCR4). I progenitori ematopoietici multipotenti (MPP) hanno dimostrato di contattare direttamente i processi delle cellule stromali reticolari che esprimono CXCL12. Esperimenti in cui CXCL12 è stato selettivamente impoverito da vari tipi di cellule note per contribuire al mantenimento di HSC e HPC (cioè, osteoblasti, cellule stromali perivascolari e reticolari) hanno dimostrato che HSC e progenitori linfoidi occupano nicchie distinte nel midollo osseo: CXCL12 prodotto da cellule endoteliali e perivascolari e da cellule stromali mesenchimali supporta la sopravvivenza delle HSC. Al contrario, la CXCL12 derivata dagli osteoblasti mantiene le HPC nel midollo osseo e sostiene i progenitori linfoidi della linea B.

CXCL12 è anche chiaramente richiesto per lo sviluppo dei primi progenitori della linea B, che sono identificati dall’espressione di c-kit, interleuchina (IL)7Rα e CD93 (AA4.1). Queste prime cellule B pre-pro migrano verso CXCL12 in vitro. Oltre ad agire come un chemioattrattore, CXCL12 promuove la loro sopravvivenza e proliferazione, agendo sinergicamente con SCF e IL-7. La maggior parte delle cellule B pre-pro B220+ Fms-related tyrosine kinase three/Fetal liver kinase 2+ (Flt3/Flk2+) contattano i corpi delle cellule stromali che esprimono CXCL12; questa adesione è mediata dall’integrina α4β1 (nota anche come antigene molto tardivo 4, VLA4) sulle cellule B che si lega alla molecola di adesione cellulare vascolare-1 (VCAM-1) sulla superficie delle cellule CXCL12+ . Queste cellule reticolari ricche di CXCL12 condividono alcune caratteristiche morfologiche con le cellule perivascolari produttrici di CXCL12 che sostengono le CSE, ma attualmente non è chiaro se esse rappresentino effettivamente una popolazione o sottoinsiemi diversi e specializzati.

Quando lo sviluppo delle cellule B progredisce con il riarrangiamento delle regioni variabili del gene della catena pesante delle immunoglobuline (Ig), le cellule pro-B (B220+c-kit+) non si trovano più in contatto diretto con le cellule CXCL12+. Invece, in questa fase si localizzano nelle vicinanze delle cellule stromali che producono IL-7, che si pensa siano una popolazione separata basata sulle colorazioni istologiche. Il raggiungimento dello stadio di cellule pre-B è accompagnato da un altro cambiamento del loro microambiente: A questo punto, quando producono una catena Igμ funzionale che si associa con la catena leggera surrogata per formare il pre-BCR, lasciano le cellule stromali IL-7+ e si spostano verso un altro sottogruppo stromale che esprime specificamente la galectina-1 (Gal1), una lectina di tipo S, sulla loro superficie. Gal1 stromale agisce come un ligando per il pre-BCR. È in grado di indurre la formazione di cluster di pre-BCR che contengono anche VLA4 e l’antigene associato alla funzione dei linfociti-1 (LFA1) nel sito di contatto con la cellula stromale. Questo contatto sinaptico è in grado di innescare l’attività tirosin-chinasica intracellulare e la trasduzione del segnale del pre-BCR, che è essenziale per la proliferazione e la differenziazione allo stadio di cellule pre-BII. Le cellule IL-7+ e Gal-1+ rappresentano popolazioni distinte di cellule mesenchimali nel midollo osseo.

Preso insieme, questo ordine ben organizzato di eventi nel contesto spaziale del midollo osseo ha portato al concetto che ci sono diverse nicchie microambientali, definite da sottoinsiemi stromali immobili residenti, che controllano l’omeostasi delle cellule B in sviluppo. Ciò implica che le cellule B, almeno transitoriamente, diventano mobili per migrare tra queste nicchie durante il loro sviluppo. Non si sa come esattamente sia regolata la transizione delle cellule tra queste varie nicchie, in particolare quali altri fattori chemiotattici siano necessari per mettere a punto la loro localizzazione, perché CXCL12 è coinvolto in più fasi del processo.

Oltre al parenchima, anche i sinusoidi del midollo osseo costituiscono siti importanti per le cellule B immature. I sinusoidi sono vasi sanguigni venosi che si diramano attraverso il parenchima midollare, convergendo in una grande vena centrale che si collega alla vena nutriente, che lascia l’osso attraverso la corteccia. I sinusoidi del midollo osseo sono rivestiti da un endotelio a parete sottile e rappresentano l’interfaccia dove le cellule B entrano in circolazione dopo aver terminato la loro maturazione nel midollo osseo. Il recettore delle chemochine CXCR4 è parzialmente responsabile della ritenzione delle cellule B nel midollo osseo. Antagonizzando la segnalazione di CXCR4 si ottiene un aumento della frequenza di cellule B mature e immature (IgDlo) nei sinusoidi del midollo e allo stesso tempo si riduce il loro numero nel parenchima, indicando che questo recettore chemochinico media la loro traslocazione nel sangue. Oltre a CXCR4, è stato dimostrato che anche il recettore 1 (S1P1) della sfingosina-1-fosfato (S1P) svolge un ruolo. Le cellule ematopoietiche, in particolare gli eritrociti, sono state indicate per produrre S1P nel sangue, portando a concentrazioni più elevate di questo sfingolipide nei sinusoidi del midollo osseo che nel parenchima, mediando così la trasmigrazione delle cellule B nei sinusoidi. Le cellule B S1P1-deficienti sono trattenute nel parenchima e mostrano una ridotta uscita nei sinusoidi; un effetto simile può essere osservato dopo aver bloccato la segnalazione S1P con la somministrazione dell’antagonista Fingolimod (FTY720).

Una volta che le cellule B hanno attraversato l’endotelio e si trovano all’interno dei sinusoidi, non lasciano immediatamente il midollo osseo con il flusso sanguigno. Invece, rimangono attaccate e strisciano lungo il lato luminale dell’endotelio sinusoidale. L’adesione all’endotelio è mediata dalla segnalazione attraverso il recettore cannabinoide-2 (CB2) sulle cellule B e attraverso l’adesione mediata da VLA4 e VCAM-1. La ritenzione prolungata delle cellule B nei sinusoidi suggerisce che i sinusoidi costituiscono una nicchia vascolare speciale per le cellule B invece di servire solo come siti di ingresso nella circolazione. Questa nozione è supportata da topi carenti di CB2, che mostrano un cambiamento nel repertorio BCR. Una panoramica schematica della localizzazione delle cellule B in via di sviluppo nel midollo osseo è rappresentata nella Figura 1.

FIGURA 1. Localizzazione delle cellule B nel midollo osseo durante lo sviluppo delle cellule B.

I progenitori ematopoietici multipotenti (MPP) sono in contatto con i processi delle cellule stromali CXCL12+. Le cellule B pre-pro, i primi precursori delle cellule B, si trovano a localizzarsi vicino ai corpi cellulari delle cellule che producono CXCL12. Le cellule pro-B più mature si trovano in contatto con le cellule stromali IL-7+. Le cellule pre-B sono attaccate alle cellule stromali Galectina-1+ tramite una sinapsi formata dal recettore delle cellule pre-B che si lega alla Galectina-1 sulla superficie delle cellule stromali e dalle interazioni mediate da LFA-1/ICAM e VLA4/VCAM. L’uscita delle cellule B nei sinusoidi del midollo osseo è mediata da S1P1 sulle cellule B che lega S1P, che è molto abbondante nel sangue. Una volta entrate nei sinusoidi, le cellule B aderiscono e strisciano lungo il lato luminale dell’endotelio, mediate da CB2 e VLA4 sulle cellule B, prima di essere rilasciate nel flusso sanguigno.