2.2 Strategie di produzione di Levan

Levan è sintetizzato come esopolisaccaride (EPS) nella matrice extracellulare di batteri di vari generi, come Acetobacter, Aerobacter, Azotobacter, Bacillus, Corynebacterium, Erwinia, Gluconobacter, Mycobacterium, Pseudomonas, Streptococcus e Zymomonas (Sarilmiser et al, 2015). Oltre a questi produttori di levan estremofili, Poli et al. (2009) hanno riportato Halomonas sp. come produttore di levan. Ulteriori studi sul potenziale utilizzo di Halomonas levan come agente bioflocculante (Sam et al., 2011), sistema di rilascio di farmaci a base di peptidi e proteine (Sezer et al., 2011, 2015), sottile biocompatibile (Sima et al., 2011, 2014), film multistrato adesivo (Costa et al., 2013), e un glicano che imita l’eparina (Erginer et al., 2016) sono stati studiati. La Fig. 12.2 mostra il processo generale di produzione del levan microbico.

Figura 12.2. Figura 12.2. Fasi di base della lavorazione a valle per il Levan.

Gli EPS microbici sono solitamente prodotti in sistemi di fermentazione aerobici e sommersi. Le condizioni di fermentazione, come l’aerazione, l’agitazione, il pH, la concentrazione di ossigeno disciolto, la temperatura, la composizione del mezzo e il design del bioreattore possono determinare le caratteristiche del prodotto e la resa della produzione. Quindi, per ottenere un’alta qualità di produzione e una resa elaborata l’ottimizzazione di questi parametri deve essere eseguita per ogni organismo (Öner et al., 2016). Per esempio, Srikanth et al. (2015) hanno studiato gli effetti dei parametri di fermentazione tra cui il pH iniziale, l’integrazione di levan, la concentrazione di saccarosio, la fonte di azoto, la concentrazione di inoculo e il tempo di coltivazione sulla sintesi di levan utilizzando Acetobacter xylinum NCIM2526 come ceppo produttore. Le condizioni ottimali sono state determinate in 10, 50-60 e 1,49 g/L per l’azoto, il saccarosio e l’inoculo, rispettivamente. La resa del levan è aumentata notevolmente dopo le prime 24 ore e la produttività massima del levan è stata ottenuta dopo 122 ore quando il pH iniziale è stato fissato a 6,8. Aumentando l’integrazione iniziale di levan da 0,1 a 0,4 g/L, la resa di levan è aumentata da 1,22 a 1,65 g/L; qualsiasi cosa al di sopra di 0,4 g/L non ha avuto un ulteriore aumento della resa. Le concentrazioni di inoculo tra il 5% (v/v) e il 10% (v/v) hanno portato a un cambiamento nella resa di levan come previsto e una resa massima (1,46 g/L) è stata raggiunta al 7% (v/v). Le concentrazioni di saccarosio da 20 a 80 g/L hanno influenzato la resa di levan. Nell’intervallo 40-50 g/L la resa di produzione era aumentata, nell’intervallo 70-80 g/L era diminuita, e nell’intervallo 20-40 g/L non era cambiata.

Sarilmiser et al. (2015) hanno studiato la produzione di levan in un microrganismo alofilo (Halomonas smyrnensis AAD6T) utilizzando vari fattori stimolatori. Per esempio, sono state applicate varie strategie di alimentazione a diversi intervalli di tempo in un sistema di batch-bioreattore, e sono state testate più condizioni iniziali in colture ad agitazione. Tra le diverse concentrazioni di pH e saccarosio testate, la resa massima di levan è stata raggiunta a pH 7 (1,345 g/L di levan) e 50 g/L di saccarosio (1,320 g/L di levan). Quando sono state applicate limitazioni di azoto e fosforo, sia la concentrazione di levan che la biomassa sono diminuite mentre i valori Yp/x sono aumentati. Le strategie di impulso di azoto hanno diminuito la sintesi di levan a causa del periodo di crescita prolungato, le strategie di impulso di saccarosio hanno migliorato significativamente la crescita cellulare e la produzione di levan, e l’impulso di NaCl non ha avuto alcun impatto sulla crescita. È interessante notare che le colture cresciute in presenza di acido borico hanno prodotto le più alte concentrazioni di levan (8,84 g/L) in condizioni di bioreattore controllato. Questo miglioramento è stato spiegato dal fenomeno biologico noto come quorum sensing (QS), in cui sono coinvolti gli atomi di boro; una delle molecole di segnalazione coinvolte nel QS in H. smyrnensis AAD6T è stata successivamente identificata come un C16-acylhomoserinelactone (Abbamondi et al., 2016).

Il peso molecolare del levan è un fattore decisivo per la sua applicabilità in varie industrie tra cui quella alimentare, cosmetica e medica (Belghith et al., 1996). Determinare le condizioni ottimizzate per la produzione di levan è fondamentale per ottenere il composto dal peso molecolare desiderato (Porras-Domínguez et al., 2015). Per esempio, Wu et al. (2013) hanno valutato sottili modifiche nel processo di produzione per acquisire diversi pesi molecolari di levan in sistemi batch e fed-batch, utilizzando Bacillus subtilis (natto) Takahashi come ceppo produttore. Quando sono state applicate alte (400 g/L) e basse (20 g/L) concentrazioni di saccarosio, sono stati ottenuti rispettivamente un peso molecolare inferiore e superiore di levan. Questa relazione lineare è stata attribuita all’effetto del saccarosio sull’enzima levansucrasi. Gli autori hanno concluso che il peso molecolare di levan dipendeva dalle condizioni di reazione, come il pH, la temperatura, la velocità di agitazione e il saccarosio, con quest’ultimo che era il fattore più efficace nel determinare il peso molecolare di levan.

La produzione di levan in sistemi cellulari immobilizzati è anche vantaggiosa poiché tali sistemi beneficiano di processi a valle relativamente facili, alta produttività volumetrica, controllo di processo avanzato e rischio di contaminazione ridotto nella produzione di EPS (Ürküt et al., 2007). L’implementazione di questo metodo favorevole per la produzione di levan può essere utilizzato un’alternativa ai processi batch, fed-batch e continui (Öner et al., 2016). Per esempio, Silbir et al. (2014) hanno valutato la produzione di levan in sistemi di fermentazione in batch e continui utilizzando Zymomonas mobilis B-14023. Le produzioni di fermentazione continua sono state eseguite in un bioreattore a letto pieno utilizzando cellule immobilizzate in Ca-alginato. Il tempo di incubazione, il pH iniziale e la concentrazione del substrato erano le tre variabili di processo più significative per la produzione di levan nel sistema batch. La più alta quantità di levan (40,2 g/L) è stata prodotta quando l’estratto di lievito è stato usato come fonte di azoto organico nelle colture in shake-flask. Inoltre, le cellule immobilizzate di Z. mobilis nel sistema di fermentazione continua sono state applicate con successo per la produzione di levan. Le cadute incontrollabili della pressione del sistema e la rottura delle perle di gel di Ca-alginato sono state le maggiori limitazioni ai tempi di fermentazione più lunghi.

Nonostante la diversità dei microrganismi produttori di levan, i costi di produzione del polisaccaride levan rimangono alti. Questo è probabilmente il più grande collo di bottiglia nella sua commercializzazione (Öner et al., 2016; Sarilmiser et al., 2015). I mezzi di fermentazione rappresentano circa il 50% dei costi di produzione di un processo microbico (Van Hoek et al., 2003); tuttavia, fonti di carbonio poco costose, come sciroppi e melassa sono stati precedentemente utilizzati per la produzione microbica di levan (Özcan e Öner, 2015). Kucukasik et al. (2011) hanno studiato la melassa di barbabietola da zucchero e la melassa di amido come sostituti del saccarosio nelle colture di Halomonas. I pretrattamenti di chiarificazione, pH, acido solforico, fosfato tricalcico e carbone attivo sono stati utilizzati in diverse combinazioni per regolare la disponibilità chimica per la produzione di levan. Si è concluso che i rendimenti massimi di levan sono stati raggiunti con una concentrazione di 10 g/L di TCPHAC sono 4,19 e 3,68 g/L, rispettivamente. Quando si utilizzano 30 g/L di TCPHAC e HAC, sono stati raggiunti rendimenti di levan di 7,56 e 4,44 g/L. La rimozione dei metalli pesanti e l’aumento della concentrazione di ferro hanno portato a una diminuzione dell’integrità cellulare e della resa di levan in questo studio. In altri studi, melassa di canna da zucchero blackstrap in Bacillus lentus V8 culture (Abou-Taleb et al., 2015), sciroppo di dattero in Mycobacterium levaniformis 1406 culture (Moosavi-Nasab et al, 2010), melassa di barbabietola da zucchero in colture di Paenibacillus polymyxa NRRL B-18475 (Han e Watson, 1992), e melassa e sciroppo di canna da zucchero in culture di Z. mobilis ATCC 31821 (De Oliveira et al, 2007) sono stati studiati come fonti di carbonio a basso costo per la produzione di levan.

La biosintesi di levan nei sistemi di fermentazione sommersa sono limitati dal requisito della crescita cellulare che potrebbe non soddisfare le condizioni ottimali per un’elevata attività di levansucrasi (Santos-Moriano et al., 2015). Tuttavia, i sistemi senza cellule eliminano questa limitazione e forniscono ulteriori vantaggi, come la facile preparazione, la riutilizzabilità e il controllo dei cambiamenti microambientali (Jang et al., 2001). Per questo motivo, offrire un ambiente ottimale per la levansucrasi è fondamentale. Per esempio, Lu et al. (2014) hanno esaminato l’influenza di vari fattori, come la concentrazione del substrato, il tempo di reazione, la temperatura e il pH sulla produzione di levan utilizzando la levansucrasi ricombinante in un sistema senza cellule. Hanno osservato una resa massima di levan (7,1 g/L) usando saccarosio 0,8 M, pH 6,5, e 40°C per 24 ore. La resa di levan è aumentata in parallelo con un aumento della concentrazione di saccarosio da 0 a 0,8 M. Il loro studio ha dimostrato che l’enzima ricombinante presenta proprietà biochimiche simili all’enzima nativo.