Caratteri e condizioni di crescita

I ceppi batterici sono elencati nella tabella supplementare 2. Escherichia coli sono stati coltivati su piastre di Luria Broth (LB) o in terreno LB liquido, integrato con 200 µg ml-1 di eritromicina a 37 °C. La trasformazione di E. coli con DNA plasmidico è stata effettuata utilizzando cellule chimicamente competenti. S. pneumoniae sierotipo 2 D39 e sierotipo 4 TIGR4 e i loro mutanti isogenici sono stati coltivati su piastre di agar sangue Columbia (Oxoid) contenenti eritromicina (5 µg ml-1) e/o cloramfenicolo (5 µg ml-1), o coltivati in brodo Todd-Hewitt integrato con 0,5% di estratto di lievito (THY; Roth) o in un terreno chimicamente definito (RPMImodi 26; GE Healthcare, Bio-Sciences), rispettivamente. La coltivazione di pneumococchi su agar sangue o in colture liquide è stata eseguita a 37 °C e 5% CO2 senza agitazione.

Costruzione dei mutanti

Per la costruzione dei mutanti tacL pneumococcici in D39 e TIGR4, un frammento di DNA costituito dal gene S. pneumoniae D39 spd_1672 e le sue regioni fiancheggiatrici a monte e a valle sono state amplificate mediante PCR dal DNA genomico utilizzando i primer SPD1672_OLup_for e SPD1672_OLdwn_rev (i primer sono elencati nella tabella 2 supplementare). I prodotti di PCR purificati sono stati clonati in pUC18 e le cellule E. coli DH5α chimicamente competenti sono state trasformate con il plasmide risultante. Il plasmide ricombinante pNH1 che ospita l’inserto di DNA desiderato è stato purificato e utilizzato come template per una reazione di PCR inversa con primer InvrevKpnISPD1672 e InvforPstISPD1672. La sequenza genica eliminata è stata sostituita da un gene ermB, amplificato mediante PCR dal vettore pTP1 utilizzando i primer InvrevKpnIErm e InforPstIErm. Il plasmide ricombinante finale è stato utilizzato per trasformare e mutagenizzare gli pneumococchi. L’efficienza di trasformazione è stata valutata utilizzando il plasmide ricombinante finale contro un altro plasmide di delezione genica (per la delezione del gene cbpL) in S. pneumoniae D39Δcps 44. Notevolmente, l’efficienza di trasformazione era quindi significativamente aumentata per la delezione tacL (2,8 colonie per ng di plasmide per cbpL contro 29,8 colonie per ng di plasmide per tacL).

I mutanti isogenici sono stati completati da un sistema in trans basato su pBAV1CpE; pBAV1CpE è stato modificato da pBAV1K-T5-gfp45, scambiando il gene di resistenza alla kanamicina con un gene di resistenza al cloramfenicolo e il promotore T5 con una regione promotore di eritromicina (pE), che include il sito di legame ribosomiale e il codone di inizio. Il gene completo spd_1672 è stato amplificato tramite PCR usando i primer 1672_com_for e Spd1672_com_rev e il frammento purificato è stato clonato in pBAV1CpE. Il plasmide pBAV-tacL risultante è stato usato per trasformare i mutanti tacL isogenici. La delezione di tacL così come la complementazione in trans sono state verificate usando qRT-PCR (Fig. 3 supplementare).

PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR)

Il ceppo D39 wild-type incapsulato e non incapsulato, il mutante tacL-deficiente e il mutante complementato sono stati coltivati in THY fino a metà della fase log (A 600 = 0,35-0,45) e raccolti per l’isolamento dell’RNA utilizzando EURx GeneMatrix Universal RNA purification kit (roboklon). La qualità dell’RNA è stata controllata mediante elettroforesi su gel di agarosio e PCR standard utilizzando i primer EnoRT_F e EnoRT_R (vedi tabella 2 supplementare). La sintesi del cDNA è stata eseguita utilizzando la trascrittasi inversa SuperScript III (ThermoFisher) e primer hexameric_random (GE Healthcare) secondo le istruzioni del produttore. La qualità del cDNA è stata controllata mediante PCR utilizzando i primer EnoRT_F e EnoRT_R e la concentrazione è stata misurata mediante nanodrop. Il cDNA è stato conservato a -20 °C fino a ulteriori test. Per gli esperimenti qRT-PCR, StepOnePlusTM Real-Time PCR System (Applied Biosystems) e SYBR® Green Master Mix (Biorad) sono stati utilizzati in combinazione con primer tacL-specifici e primer enolasi come controllo (vedi tabella supplementare 2). Il software StepOne (v. 2.3, Life Technologies) è stato utilizzato per l’analisi dei dati. I risultati finali sono presentati come grandezza della fluorescenza (ΔRn) tracciata contro il numero di cicli PCR.

Sequencing e analisi bioinformatica

Sequenziamento: 1 ng di DNA cromosomico purificato da S. pneumoniae dei ceppi D39Δcps (PN111), D39ΔcpsΔtacL (PN601), D39ΔcpsΔtacL pBAV-tacL (PN634), TIGR4Δcps (PN259), TIGR4ΔcpsΔtacL (PN603), e TIGR4ΔcpsΔtacL pBAV-tacL (PN636) è stato utilizzato per preparare librerie individuali utilizzando e seguendo l’Illumina Nextera© XT DNA Library Prep Kit. Una tecnologia Agilent 2100 Bioanalyzer servito per verificare la tagmentazione e la distribuzione delle dimensioni del frammento biblioteca finale su un chip di DNA ad alta sensibilità. Per la purificazione della libreria di DNA sono state utilizzate le microsfere AMPure XP. La libreria finale raggruppata è stata applicata a un kit MiSeq Reagent v3 600cycle e sequenziata su un sistema MiSeq come 300 ciclo paired-end run. Il pool finale della libreria è stato sottoposto a spikeing con il 5% della libreria di controllo PhiX. Una densità di cluster di 847 ± 25 (K mm-2) è stato raggiunto con il 96,46 ± 1,48% dei cluster passando specifiche del filtro. 20.3 Mio legge (94.7%) di 21.1 Mio totale legge passato specifiche del filtro, portando a 12.52 Gbp di dati di sequenza. Le letture dell’indice sono state distribuite uniformemente nei sei campioni individuali. I file FASTQ generati sono stati sottoposti a ulteriori analisi bioinformatiche come indicato di seguito.

Rilevamento e annotazione SNP: Il rilevamento SNP è stato fatto per S. pneumoniae D39Δcps, D39ΔcpsΔtacL, TIGR4Δcps, TIGR4ΔcpsΔtacL individualmente usando “snippy” (https://github.com/tseemann/snippy; parametro: porzione minima per l’evidenza della variante: 60%; copertura minima del sito della variante: ≥5 sequenze di lettura). Come genoma di riferimento è stato utilizzato Streptococcus pneumoniae D39 (NC_008533.1) o Streptococcus pneumoniae TIGR4 (NC_003028.3).

I risultanti SNPs per ogni gruppo di mutanti (D39Δcps vs. D39ΔcpsΔtacL) e (TIGR4Δcps vs. TIGR4ΔcpsΔtacL) sono stati uniti e confrontati. Copertura del genoma è stato stimato con qualimap46 utilizzando gli stessi genomi di riferimento come per la rilevazione SNP.

Isolamento di acidi teicoici pneumococcica

Estrazione e isolamento di LTA: purificazione LTA è stato eseguito fondamentalmente come descritto altrove7, ma per ottimizzare la resa di pnLTA, un dettaglio specifico è stato modificato. Le cellule pneumococciche sono state risospese in tampone citrato (50 mM, pH 4,7) e interrotto tre volte da una pressa francese (Constant Cell Disruption System, Serial No. 1020) a 10 ° C ad una pressione di 20 kPSI. SDS è stato aggiunto ad una concentrazione finale del 4% ai surnatanti combinati. La soluzione è stata incubata per 30 min a 100 °C e successivamente è stata agitata per una notte a temperatura ambiente. La soluzione è stata centrifugata a 30.000×g per 15 min a 4 °C. Il pellet è stato lavato quattro volte con tampone citrato utilizzando le condizioni di centrifugazione come sopra. I surnatanti combinati contenenti LTA e il sedimento risultante, contenente il complesso grezzo PGN-WTA, sono stati liofilizzati separatamente. I solidi risultanti sono stati entrambi lavati cinque volte con etanolo (centrifugazione: 20 min, 20 ° C, 10.650 × g) per rimuovere SDS e liofilizzato (portando a pellet A contenente LTA e pellet B contenente il PGN-WTA complesso). Per l’isolamento LTA, pellet A è stato risospeso in tampone citrato ed estratto con un volume uguale di butan-1-ol (Merck) a temperatura ambiente sotto agitazione vigorosa. Le fasi sono state separate mediante centrifugazione a 2.100×g per 15 minuti a 4 °C. La fase acquosa (contenente LTA) è stato raccolto, e la procedura di estrazione è stata ripetuta due volte con la fase organica più interfase. Le fasi acquose combinate sono stati liofilizzati e successivamente dializzati per 5 giorni a 4 ° C contro 50 mM tampone acetato di ammonio (pH 4,7; 3,5 kDa membrana cutoff), il buffer è stato cambiato ogni 24 ore. Il LTA greggio risultante è stato purificato ulteriormente da cromatografia interazione idrofobica (HIC) eseguita su una colonna HiPrep Octyl-Sepharose (GE Healthcare, 16 × 100 mm, volume del letto 20 ml). Il materiale grezzo LTA è stato sciolto in tampone di partenza poco (15% propan-1-olo (Roth) in 0,1 M ammonio acetato (pH 4,7)) come possibile e centrifugato a 13.000 × g per 5 min a temperatura ambiente e il surnatante risultante è stato liofilizzato. Il pellet contenente LTA è stato sciolto nel buffer di partenza HIC ad una concentrazione di 30 mg ml-1 e purificato da HIC utilizzando un gradiente lineare dal 15 al 60% propan-1-olo (Roth) in 0,1 M acetato di ammonio (pH 4,7). LTA contenenti frazioni sono stati identificati da un test fotometrico fosfato47. Le frazioni contenenti fosfato sono stati combinati, liofilizzati, e lavato con acqua su liofilizzazione per rimuovere tampone residuo.

Estrazione e isolamento di WTA: isolamento WTA ed estrazione è stata effettuata come descritto altrove 11, ma con lievi modifiche. Pellet B (contenente il complesso grezzo PGN-WTA), che è sorto durante l’isolamento LTA, è stato risospeso ad una concentrazione di 10 mg ml-1 in 100 mM Tris-HCl (pH 7,5) contenente 20 mM MgSO4. La DNasi A e la RNasi I sono state aggiunte a concentrazioni finali di 10 e 50 µg ml-1, rispettivamente. La sospensione è stata agitata per 2 ore a 37 °C. Successivamente, sono stati aggiunti 10 mM CaCl2 e tripsina (100 µg ml-1) e l’agitazione è stata continuata per una notte a 37 °C. È stato aggiunto SDS a una concentrazione finale dell’1% e la miscela è stata incubata per 15 minuti a 80 °C per inattivare gli enzimi. La parete cellulare è stata recuperata mediante centrifugazione per 45 minuti a 130.000×g a 25 °C. Il pellet risultante è stato risospeso in 0,8 ml 8 M LiCl per 1 ml inizialmente utilizzato soluzione Tris-HCl e incubato per 15 min a 37 ° C. Dopo un’altra centrifugazione utilizzando le stesse condizioni di cui sopra, il pellet è stato risospeso in 1 ml 10 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA, pH 7,0) per ml della soluzione Tris-HCl utilizzato inizialmente e questo campione è stato incubato a 37 ° C per 15 min. Il pellet è stato lavato due volte con acqua. Infine, il pellet è stato risospeso in 2-4 ml di acqua e liofilizzato, ottenendo il complesso PGN-WTA purificato. A seconda della specifica domanda di ricerca, sono stati eseguiti successivamente ulteriori trattamenti chimici o enzimatici.

Trattamenti chimici ed enzimatici

Trattamento con idrazina di LTA: LTA purificata è stata sciolta ad una concentrazione di 5 µg µl-1 in idrazina anidra (N2H4; ICN Biomedicals) prima dell’incubazione per 1 ora a 37 °C mentre veniva agitata. La reazione è stata spenta aggiungendo lo stesso volume di acetone e asciugata sotto un flusso di azoto; la fase di asciugatura è stata ripetuta due volte. Successivamente, l’LTA grezzo de-O-acetilato è stato purificato mediante cromatografia a permeazione di gel (GPC) su un Bio-Gel P-10 (45-90 µm, BioRad; dimensione della colonna: 1,5 × 120 cm; tampone: 150 mM ammonio acetato (pH 4,7)) colonna.

Digestione enzimatica del complesso PGN-WTA: Per rimuovere tutti gli amminoacidi dal PGN, il complesso PGN-WTA è stato sciolto in 50 mM Tris-HCl (pH 7,0; 10 mg ml-1) e trattato con il pneumococco LytA amidasi come descritto altrove11. Ricombinante His-tagged LytA amidasi (10 µg LytA per mg) è stato aggiunto in tre aliquote dopo 0, 24 e 48 h per un periodo totale di incubazione di 72 h a 37 ° C. Successivamente, l’enzima è stato inattivato mediante bollitura per 5 minuti a 100 °C. Dopo la centrifugazione (25.000×g, 15 min, 20 ° C), il surnatante è stato raccolto e liofilizzato. Il complesso grezzo LytA-trattato PGN-WTA è stato ulteriormente purificato mediante GPC su un Bio-Gel P-30 (45-90 µm, BioRad; dimensione della colonna: 1,5 × 120 cm; buffer: 150 mM ammonio acetato (pH 4.7)). Il materiale ad alto peso molecolare ottenuto (~12 mg) è stato ulteriormente digerito con lisozima (200 µg; Sigma) e mutanolisina (200 µg; Sigma) in una miscela di reazione da 800 µl contenente fosfato di sodio (20 mM; pH 4,8) e azide di sodio (0,02%) a 37 °C per una notte. Gli enzimi sono stati inattivati mediante riscaldamento a 100 °C per 5 minuti. Il materiale solubile è stato recuperato mediante centrifugazione (18.000×g, 10 min, 20 °C) e liofilizzato. Isolamento del pnWTA legato a piccoli frammenti PGN è stato ottenuto da un GPC finale utilizzando le condizioni di cui sopra.

Spettroscopia NMR

Misure spettroscopiche NMR sono state effettuate in D2O a 300 K su un Bruker AvanceIII 700 MHz (dotato di un inverso 5 mm quadrupla risonanza Z-grad crioprobe). I solventi deuterati sono stati acquistati da Deutero GmbH (Kastellaun, Germania). L’acetone è stato utilizzato come standard esterno per calibrare 1H (δH 2.225) e 13C (δC 30.89) spettri NMR. 31P spettri NMR (δP 0,0) sono stati calibrati con 85% di acido fosforico in D2O come standard esterno. 1H NMR assegnazioni sono state confermate da due dimensioni 1H, 1H COSY e TOCSY esperimenti, e 13C NMR assegnazioni sono state indicate da due dimensioni 1H, 13C HSQC, sulla base delle assegnazioni 1H NMR. La connettività interresiduale e ulteriori prove per l’assegnazione 13C sono state ottenute da esperimenti bidimensionali 1H, 13C HMBC e 1H, 13C HSQC-TOCSY. La connettività del gruppo fosfato è stata assegnata da 1H bidimensionale, 31P HMQC e 1H, 31P HMQC-TOCSY. Tutti i dati sono stati acquisiti ed elaborati utilizzando Bruker TOPSIN V 3.0 o superiore.

Spettrometria di massa

Per analizzare il pnWTA legato a piccoli frammenti di PGN, la spettrometria di massa a risonanza di ciclotrone a ionizzazione di fourier-transform (ESI-FT-ICR-MS) è stata eseguita su uno strumento APEX Qe 7 Tesla (Bruker Daltonics, Brema, Germania) utilizzando la modalità ioni negativi e una miscela di acqua/propan-2-olo/7 M trietilamina/acido acetico (50:50:0.06:0.02 v/v/v/v) come solvente, come descritto in precedenza6. Analisi MS di idrazina trattata LTA è stato fatto su un Q Exactive Plus (Thermo Scientific, Brema, Germania) in modalità ioni negativi utilizzando lo stesso solvente. Un Triversa Nanomate (Advion, Ithaca, USA) sorgente ionica è stato utilizzato con una tensione di spruzzo impostato a -1,1 kV. La scala di massa è stato calibrato esternamente con glicolipidi di struttura nota, e tutti gli spettri sono stati carica deconvoluto. I numeri di massa indicati si riferiscono alla massa monoisotopica delle molecole neutre.

Microscopia elettronica

Microscopia elettronica a scansione a emissione di campo: i batteri sono stati fissati nel terreno di crescita con formaldeide al 5% e glutaraldeide al 2,5% per 1 ora in ghiaccio e lavati con tampone HEPES (HEPES 0,1 M, saccarosio 0,09 M, 10 mM CaCl2, 10 mM MgCl2, pH 6,9). Un’aliquota di 50 µl della soluzione batterica fissata è stata posta su coprioggetti rivestiti di poli-l-lisina e lasciata depositare per 10 minuti. Dopo la fissazione con glutaraldeide al 2% in PBS per 5 min a temperatura ambiente, i coprioggetti sono stati lavati con tampone TE (20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 6.9) prima della disidratazione in una serie graduale di acetone (10, 30, 50, 70, 90, e 100%) in ghiaccio per 10 min per ogni fase. I campioni nella fase di acetone al 100% sono stati lasciati raggiungere la temperatura ambiente prima di un altro passaggio in acetone al 100% prima dell’essiccazione al punto critico con CO2 liquido (CPD 30, Balzers, Liechtenstein). I campioni essiccati sono stati coperti con un film di palladio-oro mediante sputter coating (SCD 500, Bal-Tec, Liechtenstein) prima dell’esame in un microscopio elettronico a scansione a emissione di campo Zeiss Merlin (Oberkochen, Germania) utilizzando il rivelatore HESE2 Everhart Thornley SE e il rivelatore in-lens SE in un rapporto 25:75 ad una tensione di accelerazione di 5 kV.

Microscopia elettronica a trasmissione: i batteri sono stati fissati come sopra e ulteriormente fissati con tetrossido di osmio (1% in tampone HEPES) per 1 ora a temperatura ambiente. Dopo il lavaggio con tampone HEPES, i campioni sono stati disidratati con 10, 30 e 50% di acetone su ghiaccio prima dell’incubazione in acetone al 70% con 2% di acetato di uranile per una notte a 7 °C. I campioni sono stati ulteriormente disidratati con 90 e 100% acetone su ghiaccio, lasciati raggiungere la temperatura ambiente e ulteriormente disidratati con 100% acetone, poi cambiati in 100% etanolo. Successivamente, i campioni sono stati infiltrati con la resina acrilica aromatica LRWhite. Dopo la polimerizzazione per 2 giorni a 50 °C, le sezioni ultrasottili sono state tagliate con un coltello diamantato, raccolte su griglie 3000 mesh rivestite di butvar e controcolorate con 4% di acetato di uranile acquoso per 3 minuti. I campioni sono stati ripresi in uno Zeiss TEM 910 ad una tensione di accelerazione di 80 kV e ad ingrandimenti calibrati.

Contrasto e luminosità sono stati regolati con Adobe Photoshop CS3.

Generazione di anticorpi

Gli anticorpi policlonali contro i CBP analizzati sono stati allevati nei topi utilizzando protocolli di immunizzazione di routine. In breve, i topi CD-1 sono stati immunizzati intraperitonealmente con 20 µg di proteina ricombinante e adiuvante incompleto di Freund (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germania) (50:50 v/v). Al 14° e 28° giorno, i topi sono stati alimentati con 20 µg di proteina e adiuvante incompleto di Freund (50:50 v/v). I topi sono stati dissanguati al giorno 42 e le IgG policlonali sono state purificate dal siero usando la proteina A-Sepharose (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germania). Gli anticorpi sono elencati nella tabella supplementare 2.

Citometria a flusso

S. pneumoniae D39 wild type, il suo mutante isogenico tacL, e il mutante completato sono stati coltivati in mezzo THY a metà fase log, raccolti a 3.275×g per 6 min, e lavati con PBS (pH 7,4). Per la quantificazione del contenuto delle capsule, una sospensione di 100 µl contenente 4 × 108 batteri è stata incubata con antisieri anti-polisaccaridi capsulari (SSI Type serum 2, Statens Serum Institute) (1:500 in PBS) per 30-45 min a 37 °C e 5% CO2 in piastre da 96 pozzetti (U-bottom, Greiner Bio-One). Dopo il lavaggio, i campioni sono stati incubati con un anticorpo secondario di capra anti-rabbit IgG-accoppiato Alexa488 (Invitrogen) (1:500 in PBS, 30-45 min, 37 °C). Dopo il lavaggio con PBS, i batteri sono stati fissati con 1% di formaldeide per una notte a 4 ° C.

L’abbondanza di CBPs così come la quantità di acidi teicoici in non incapsulati D39 wild-type, ceppi mutanti e complementati sono stati misurati mediante citometria a flusso dopo la fissazione con 1% di formaldeide per 1 h a 4 ° C. Duecento µl di sospensioni contenenti 8 × 108 batteri sono stati incubati con anticorpi policlonali specifici contro diversi CBP (1:500 in PBS), o per la quantificazione degli AT con anticorpi contro il P-Cho (TEPC-15) o l’antigene Forssman (15 min a 37 °C e 5% CO2) in piastre da 96 pozzetti (U-bottom, Greiner Bio-One). Dopo il lavaggio, i campioni sono stati incubati con un anticorpo secondario di capra anti-IgG-accoppiato Alexa488 (Invitrogen) (15 min, 37 °C). La fluorescenza è stata determinata utilizzando un FACS Calibur™ (BD Biosciences).

Analisi immunoblot

S. pneumoniae D39, il suo mutante isogenico tacL e il mutante complementato sono stati coltivati in terreno THY fino a raggiungere un A 600 di 0,35-0,45, raccolti mediante centrifugazione a 3270×g a 4 °C per 6 min, e risospesi in 1 ml di tampone PBS a pH 7,4. Un totale di 2 × 108 cellule per pozzetto sono state caricate ed eseguite su una SDS-PAGE al 12% prima di essere trasferite su una membrana di nitrocellulosa tramite blotting semidry. Le membrane sono state bloccate per 2 ore a temperatura ambiente con latte scremato al 5% (Roth) e Tris-buffered saline (TBS; pH 7.4) e incubate per una notte a 4 °C con anticorpi policlonali di topo contro diversi CBPs (1:500 in 5% latte scremato + TBS 0,01% Tween (T-TBS)). Un anticorpo policlonale di coniglio contro l’enolasi (1:25.000 in 5% latte scremato + T-TBS) è stato usato come controllo di carico. Le membrane sono state lavate con T-TBS, le CBP sono state rilevate con il secondario marcato con fluorescenza IRDye® 800CW. Le IgG di topo α di capra e l’enolasi sono state rilevate con l’IRDye® 680RD marcato in fluorescenza. L’anticorpo di capra α-rabbit IgG è stato rilevato mediante incubazione con l’anticorpo appropriato (1:15.000 in latte scremato al 5% in T-TBS) per 45 minuti al buio a temperatura ambiente; le membrane sono state lavate con T-TBS e infine una volta con TBS. La scansione delle membrane è stata eseguita utilizzando uno scanner Odyssey® CLx (LI-COR).

Saggio di autolisi indotta da Triton X-100

S. pneumoniae D39 wild-type, mutante e ceppo complementato sono stati coltivati in THY medium fino alla fase mid-log, raccolti a 3275×g per 6 min e lavati con PBS (pH 7,4). Una sospensione di 1 ml contenente 1 × 109 batteri è stata incubata con una concentrazione finale di 0,01% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germania) e incubata a 37 °C. Lisi delle cellule batteriche è stata monitorata misurando l’assorbanza a 600 nm in punti di tempo predefiniti.

Saggio di aderenza epiteliale

L’aderenza pneumococcica alle cellule epiteliali è stata analizzata con cellule umane A549 (ATCC® CCl-185TM) come descritto48. Brevemente, cellule epiteliali confluenti, cresciute su vetrini coprioggetto (Hartenstein; in piastre da 24 pozzetti, ~ 1 × 105 cellule per pozzetto) sono stati inoculati con 5 × 106 pneumococchi medio-esponenziale cresciuto e incubato in mezzo di infezione (DMEM (HyClone ™) + 1% calore inattivato siero fetale bovino (FBS)) a 37 ° C e 5% CO2. Successivamente, le cellule sono state lavate tre volte con soluzione salina tamponata con fosfato contenente 1% FBS (Gibco) per rimuovere i batteri non legati. In seguito, i batteri sono stati fissati con PBS contenente 1% di para-formaldeide (PFA, Roth).

Microscopia a immunofluorescenza

Gli pneumococchi fissati, legati alle cellule A549 sono stati lavati tre volte con PBS e bloccati per 1 h a temperatura ambiente con PBS + 10% FBS. Dopo il lavaggio, i campioni sono stati incubati per 1 h a temperatura ambiente con un anticorpo policlonale (1:500, Davids Biotechnologie GmbH) contro gli pneumococchi (generato nel coniglio contro S. pneumoniae TIGR4 e D39 inattivato al calore). Come anticorpo secondario, è stato utilizzato l’anticorpo di capra anti-rabbit marcato con fluorescenza Alexa-Fluor488 (Abcam) (1:500, 1 h, temperatura ambiente). L’adesione batterica è stata monitorata per almeno 20 cellule per vetrino coprioggetto usando la microscopia a fluorescenza. Ogni esperimento è stato ripetuto tre volte in duplicato. Tutti i dati sono riportati come mezzi ± s.d. L’analisi statistica è stata eseguita utilizzando il test t di Student a due code non accoppiate. In tutte le analisi, un valore p di <0,05 è stato considerato statisticamente significativo.

Esperimenti di fagocitosi

Saggio di protezione antibiotica: Uno strato confluente di cellule monocitiche THP-1 (ATCC® TIB-202TM) coltivate in piastre da 24 pozzetti (3 × 105 cellule per pozzetto in RPMI-1640 (HyClone™) integrato con 10% di siero fetale bovino inattivato al calore (FBS, Gibco)) è stato differenziato in fagociti con l’aggiunta di 200 nmol ml-1 di forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA, Sigma-Aldrich) e incubato per 48 ore a 37 °C e 5% CO2. In seguito, le cellule THP-1 sono state lavate con RPMI-1640 integrato con 10% di FBS inattivato al calore e incubate per altre 24 ore a 37 °C e 5% CO2. Prima infezione pneumococchi sono stati coltivati in THY a metà fase log (A 600 = 0,35-0,45), centrifugato, e lavato con mezzo di infezione (RPMI-1640 integrato con 1% FBS inattivato al calore). Le cellule THP-1 sono state lavate e infettate con pneumococchi in 500 µl di mezzo di infezione. L’infezione è stata sincronizzata mediante centrifugazione (2 min, 300×g) per avviare un contatto simultaneo tra batteri e fagociti. Successivamente le cellule sono state incubate a 37 °C e 5% CO2 per diversi periodi di tempo. Dopo l’infezione, le cellule sono state lavate con mezzo di infezione e incubate con penicillina G (100 unità ml-1, Sigma-Aldrich) e gentamicina (0,1 mg ml-1, Sigma-Aldrich) per 1 h a 37 °C e 5% CO2 per uccidere i batteri extracellulari. Poi, i fagociti sono stati lavati e lisati con 1% saponina (Sigma-Aldrich) per rilasciare pneumococchi intracellulari. Unità formanti colonie (cfu) di batteri intracellulari sono stati determinati placcando i batteri in diluizioni appropriate su piastre di agar sangue (Oxoid)49. Tempo-dipendente uccisione di pneumococchi intracellulari è stato valutato uccidendo pneumococchi extracellulari utilizzando antibiotici come descritto sopra. Successivamente, i fagociti sono stati ulteriormente incubati in mezzo di infezione per diversi periodi di tempo (0-3 h). I cfu batterici intracellulari sono stati monitorati come descritto sopra. Tutti gli esperimenti sono stati ripetuti quattro volte come duplicati. I dati sono stati normalizzati nei saggi di protezione antibiotica alla molteplicità di infezione (MOI) o nel tempo-dipendente uccisione ai batteri recuperati al punto di tempo 0 h. Tutti i saggi sono stati analizzati utilizzando una via ANOVA con correzione Bonferroni.

Macchiatura a doppia immunofluorescenza e microscopia

Le cellule THP-1 differenziate PMA (3 × 105 cellule per pozzetto) sono state coltivate su vetrini sterili (12 mm, Hartenstein) e infettate con pneumococchi come descritto sopra. Dopo l’infezione, le cellule THP-1 sono state lavate con il mezzo di infezione e fissate con para-formaldeide 4% (Roth) durante la notte a 4 °C. Vetrini sono stati lavati con PBS e bloccato con PBS + 10% FBS inattivato al calore per 1 h. Dopo il lavaggio, i batteri extracellulari sono stati colorati utilizzando un policlonale α-pneumococchi IgG (1:500) e un Alexa-Fluor488-marcato secondario capra α-rabbit IgG (1:500, Abcam) per 30 min a temperatura ambiente. I coprioggetti di vetro sono stati lavati tre volte con PBS dopo la permeabilizzazione delle cellule THP-1 con 0,1% Triton X-100 in PBS (10 min, temperatura ambiente). Dopo il lavaggio, gli pneumococchi intracellulari sono stati colorati utilizzando un policlonale α-pneumococchi IgG (1:500) e un secondario Alexa-Fluor568-labeled capra α-rabbit IgG (1:500, Abcam) per 30 min a temperatura ambiente. Gli esperimenti sono stati ripetuti tre volte come duplicati. Per l’analisi statistica, 50 cellule per vetrino sono state analizzate per il numero di batteri intracellulari. I dati sono stati normalizzati al MOI. Tutti i saggi sono stati analizzati utilizzando un modo ANOVA con correzione Bonferroni. In tutte le analisi, un valore p di <0,05 è stato considerato statisticamente significativo.

Line cellulari

Tutte le linee cellulari usate in questo studio sono state acquistate da ATCC (A549: ATCC CCL-185; THP-1: ATCC TIB-202) e sono state testate per essere micoplasma-negative tramite PCR e microscopia elettronica a scansione.

Polmonite acuta del topo e modello di infezione sistemica

I topi CD-1 femmina di 8-10 settimane (outbred, Charles River, Sulzfeld, Germania) sono stati infettati intranasalmente con pneumococchi bioluminescenti come descritto recentemente50. Brevemente, pneumococchi sono stati coltivati a metà fase esponenziale (A 600 = 0,35) in mezzo THY contenente 10% di calore inattivato siero fetale bovino. Dopo la centrifugazione, la dose di infezione (20 µl) è stata regolata a ~ 2,5 × 107 cfu in PBS (pH 7,4). Per l’infezione nasale, i topi sono stati anestetizzati mediante iniezione intraperitoneale di ketamina/xylazina (Ketanest S, Pfizer Pharma, Karlsruhe, Germania; Rompun, Provet AG, Lyssach, Germania), e i batteri sono stati somministrati per caduta nelle narici. Il cfu della dose di infezione è stata confermata dalla placcatura di diluizioni seriali dell’inoculo su piastre di agar sangue. I topi sono stati monitorati per la sopravvivenza e imaged per bioluminescenza a intervalli prescelti utilizzando il IVIS ® Spectrum Imaging System (Caliper Life Sciences, Hopkinton, USA). Per il modello di infezione sistemica, una dose di infezione di 3 × 103 cfu è stata somministrata per via intraperitoneale in un volume di 200 µl di PBS (pH 7,4). Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti secondo i regolamenti tedeschi della Società per la scienza degli animali da laboratorio (GV-SOLAS) e la legge sanitaria europea della Federazione delle associazioni di scienza degli animali da laboratorio (FELASA). Tutti gli esperimenti sono stati approvati dal Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei Mecklenburg – Vorpommern (LALLFV M-V, Rostock, Germania, permesso n. 7221.3-1-056/16-1).

Data availability

I file grezzi FASTQ contenenti i dati della sequenza genomica di S. pneumoniae sono stati inviati all’EMBL-EBI European Nucleotide Archive (ENA) e conservati nello Short Read Archive (SRA) con il numero di adesione allo studio RJEB18558. Tutti gli altri dati rilevanti che supportano i risultati dello studio sono disponibili in questo articolo e i suoi file di informazioni supplementari, o dagli autori corrispondenti su richiesta.