L’avvento della medicina “di precisione” è caratterizzato da molti nuovi miglioramenti nei metodi e nei regimi diagnostici, prognostici e terapeutici. Come parte di questa iniziativa, c’è stata un’attenzione per ridurre al minimo la quantità di tessuto necessario per i test attraverso procedure meno invasive e più sicure. Un metodo che ha attirato un notevole interesse negli ultimi anni è la “biopsia liquida”. Mentre le definizioni variano sul significato preciso di questo termine, si può pensare in generale alla raccolta di un campione di fluido corporeo per testare i biomarcatori rilevanti per informare la gestione del paziente. È più comunemente applicata alla raccolta di sangue periferico per l’analisi degli acidi desossiribonucleici (DNA) tumorali circolanti privi di cellule.

La prima descrizione del DNA circolante privo di cellule nel sangue umano fu nel 1948, ma questo raccolse poca attenzione nella comunità scientifica più ampia 2. Nel 1977, gli scienziati hanno identificato la presenza di livelli anormalmente elevati di DNA libero da cellule (cfDNA) nel plasma e nel siero di pazienti affetti da cancro rispetto ai pazienti di controllo della salute e questo cfDNA è stato presunto rappresentare principalmente il DNA tumorale circolante (ctDNA)1,5. Da questa descrizione originale, altre ricerche hanno scoperto che l’aumento del cfDNA riflette generalmente una moltitudine di processi patologici, tra cui condizioni neoplastiche maligne e benigne, malattie infiammatorie, ictus, traumi e sepsi. Durante questi processi, gli acidi nucleici possono essere versati nel sangue da cellule apoptotiche e necrotiche o dalla secrezione controllata da cellule viventi2,11. Mentre il DNA privo di cellule è spesso usato come sinonimo di DNA tumorale circolante, si dovrebbe ricordare che il DNA circolante non tumorale e non umano può anche essere presente in un campione.

Mentre l’attenzione attuale è dominata dal DNA, ulteriori componenti di una biopsia liquida includono acidi ribonucleici (RNA), cellule tumorali circolanti (CTCs), vescicole extracellulari (EVs) e piastrine educate dal tumore (TEPs). Questi ultimi componenti sono principalmente di interesse per la ricerca. Con l’aumento della ricerca traslazionale, questi componenti aggiuntivi di una biopsia liquida potrebbero avere un uso clinico crescente in futuro. Una revisione di questi elementi va oltre lo scopo di questo articolo e si rimanda il lettore all’articolo di Batth et al per ulteriori letture.

Considerazioni tecnologiche

Fino a poco tempo fa, la tecnologia disponibile non è stata abbastanza sensibile per rilevare il ctDNA e farne un uso significativo. A differenza dei saggi molecolari eseguiti sui fluidi corporei per il rilevamento di acidi nucleici da virus e altri microrganismi che beneficiano di quantità relativamente grandi di acidi nucleici, i frammenti di acido nucleico tumorale circolanti presentano una frazione del normale cfDNA non tumorale. Il ctDNA è solitamente costituito da piccoli frammenti di DNA nell’intervallo di 140-170 paia di basi (bp)3 e il tipo di tumore, la progressione, il peso, i tassi di proliferazione e la terapia influenzano la quantità di ctDNA in un campione. Inoltre, anche se il ctDNA è relativamente stabile nel plasma e nel siero, viene rimosso dalla circolazione dal fegato e dai reni entro poche ore 3,4. Ciononostante, i progressi nei processi pre-analitici e nei metodi di purificazione hanno permesso di catturare, amplificare e sequenziare con successo il ctDNA.

I metodi attualmente utilizzati per rilevare o misurare il ctDNA possono essere ampiamente suddivisi in due categorie: reazione a catena della polimerasi (PCR) e sequenziamento di prossima generazione (NGS). I test basati sulla PCR hanno generalmente un tempo di risposta più veloce e sono meno costosi, ma tipicamente possono valutare solo una o poche mutazioni specifiche alla volta (capacità di multiplexing limitata). Gli approcci basati sulla PCR possono essere ulteriormente suddivisi in metodi che arricchiscono le sequenze mutanti rispetto a quelle wild-type (non mutanti) e quelli che raggiungono la quantificazione attraverso la compartimentazione. Un esempio di quest’ultimo gruppo è la “PCR digitale” che sta diventando ampiamente utilizzata per il rilevamento e la quantificazione di specifiche mutazioni note nel ctDNA. La PCR è compartimentalizzata in migliaia di piccoli volumi di reazione individuale, sia su un chip che creando goccioline di acqua in olio. Ogni compartimento o gocciolina contiene o meno un frammento di template mirato e produce un segnale fluorescente se in quel volume è presente un frammento di template appropriato. Contando i singoli volumi fluorescenti, è possibile stimare il numero di molecole di template specificamente mirate nel campione. Per obiettivi multipli testati contemporaneamente (multiplexing), diversi segnali fluorescenti possono essere assegnati a specifiche sequenze di varianti.

Gli approcci basati sul sequenziamento di nuova generazione permettono la valutazione di una gamma molto più ampia di possibili mutazioni perché il sequenziamento può rilevare mutazioni che si verificano ovunque all’interno delle regioni catturate. Per mirare alle regioni del genoma soggette a mutazioni, le librerie NGS possono essere preparate dal DNA plasmatico utilizzando metodi di cattura per legatura/ibrido o metodi di arricchimento PCR mirati. Le frazioni alleliche delle varianti sono generalmente molto più basse nelle biopsie liquide rispetto alle biopsie dei tessuti, spesso <1%, quindi le regioni di interesse devono essere sequenziate più profondamente che in NGS del tessuto tumorale primario. Inoltre, un’ampia ottimizzazione dei processi preanalitici e analitici deve essere fatta per massimizzare il campione di input e ridurre gli errori di PCR e di sequenziamento. Gli approcci NGS hanno l’importante vantaggio di poter raggiungere una copertura di mutazione molto più ampia (analisi simultanea di migliaia di possibili mutazioni). Quindi, la conoscenza preliminare delle mutazioni specifiche del tumore non è necessaria. Tuttavia, rispetto ai metodi più semplici basati sulla PCR, le tecniche NGS sono più costose, richiedono più tempo e sono tecnicamente più impegnative.

Avantaggi e svantaggi

I vantaggi delle biopsie liquide risiedono principalmente nella natura molto meno invasiva delle procedure per ottenerle rispetto alle biopsie tumorali standard. Consideriamo, per esempio, il processo necessario per la biopsia di una massa polmonare. Se la massa si trova in una posizione accessibile tramite radiologia interventistica o biopsia chirurgica, c’è un rischio di pneumotorace o emorragia, nonostante il costo di mantenere una suite operativa in cui eseguire l’operazione. Le biopsie liquide consentono anche campionamenti più frequenti e seriali nel tempo per fornire una maggiore risoluzione al comportamento dei tumori, nonché la loro risposta alla terapia. Ad esempio, in uno studio i pazienti con cancro colorettale che successivamente hanno dimostrato radiograficamente una buona risposta al trattamento avevano un calo di >90% dei livelli di ctDNA dopo le prime 2 settimane di trattamento 9. Questo ha dimostrato di stratificare il rischio di recidiva dopo la resezione con intento curativo. In un altro studio, pazienti con cancro al seno con ctDNA rilevabile dopo la resezione aveva un rischio 25 volte superiore di recidiva 10. Questi concetti sono analoghi ai test che si fanno attualmente per i tumori maligni ematologici, come la leucemia mieloide cronica (CML) e i test seriali per la presenza di trascrizioni di fusione BCR-ABL. Infine, nei casi in cui non è disponibile una biopsia dei tessuti, il profilo molecolare dei tumori può ancora essere eseguito tramite biopsia liquida.

Gli svantaggi importanti della biopsia liquida includono la necessità di una diagnosi istologica iniziale da ottenere tramite biopsia dei tessuti. I laboratori che eseguono questi test devono essere consapevoli dell’utilizzo appropriato del test e del potenziale di “interpretazione eccessiva” nel contesto clinico. La bassa frequenza di varianti nel sangue periferico può portare a tassi di falsi negativi più elevati e richiedere sforzi tecnici e competenze significativamente maggiori per ottenere risultati affidabili.

Applicazioni attuali ed emergenti

L’uso clinico della biopsia liquida è aumentato significativamente dal 2014, quando la prima piattaforma di biopsia liquida multigene disponibile in commercio è diventata disponibile. Diversi saggi sono disponibili in commercio e approvati dalla FDA, e alcuni sono considerati sufficienti per l’ammissibilità al trattamento dalle compagnie di assicurazione. Ad esempio, nel 2016 la FDA ha approvato il cobas® EGFR Mutation Test v2 per determinare l’ammissibilità dei pazienti con cancro al polmone non a piccole cellule a ricevere alcuni inibitori della tirosin-chinasi EGFR . L’adozione della biopsia liquida per escludere i pazienti dalla terapia mirata ha visto un’adozione clinica molto più lenta, soprattutto a causa delle preoccupazioni per i falsi negativi e il tessuto tumorale generalmente accessibile 3.

Gli usi emergenti per le biopsie liquide includono il loro uso come un complemento alla biopsia del tessuto profilo mutazionale, valutando la risposta al trattamento, il monitoraggio della malattia residua, il rilevamento di recidiva della malattia e il monitoraggio per l’emergere di mutazioni di resistenza 3.

Direzioni future

La specificità prevista delle mutazioni rende il ctDNA un biomarcatore attraente per la diagnosi precoce del cancro, che potrebbe avere un impatto enorme sulla cura dei pazienti. Tuttavia, poiché i tumori in fase iniziale sono noti per rilasciare molto poco DNA, ci sono molte sfide tecniche da superare. Anche se la biopsia liquida può essere uno strumento attraente per lo screening del cancro in pazienti asintomatici, tali applicazioni dovranno essere attentamente e ponderatamente considerate per evitare un’eccessiva sofferenza del paziente e costi dovuti a risultati falsi positivi. A breve termine, le biopsie liquide possono essere più utili per confermare la malignità in pazienti con lesioni già clinicamente o radiograficamente evidenti.

Conclusione

La letteratura incentrata sul test del ctDNA si sta rapidamente espandendo ed evolvendo. Le aree di indagine in corso includono i processi pre-analitici, i fattori che influenzano il tasso di rilevamento del ctDNA e gli studi clinici prospettici. È probabile che vedremo un ruolo più prevalente del ctDNA nella cura clinica, poiché la continua ricerca su CTC, cfDNA/RNA e vescicole extracellulari fornirà una maggiore risoluzione all’istantanea dello stato del tumore ottenuta attraverso le biopsie liquide 4.

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