Saggi biologici di bradichinina e relative chinine
Le chinine sono potenti agenti ipotensivi in tutte le specie animali studiate (54). Il più comune test in vivo per questi peptidi è la pressione sanguigna del ratto, descritto in precedenza. Gli effetti vasodilatatori delle chinine sono misurati in organi perfusi isolati con endotelio intatto, secondo la procedura descritta nella sezione IV. L’effetto rilassante delle chinine nei vasi arteriosi è valutato in vitro nell’arteria carotidea del cane (57) usando il metodo descritto da Regoli e Barabé (34). L’effetto venocostrittore è misurato in vitro nella vena giugulare di coniglio (42), secondo la procedura riassunta di seguito.
Le vene, prese da conigli (1,0-2,0 kg), sono tagliate in strisce elicoidali larghe 2 mm e lunghe 2 cm e sospese in soluzione di Krebs (ossigenata a 37°C) contenente un inibitore dell’enzima di conversione (Captopril, 10 μM) per prevenire la degradazione della chinina (34). Le contrazioni dei tessuti in risposta alle chinine sono registrate come descritto in precedenza e le curve di concentrazione-risposta complete sono solitamente misurate per valutare le affinità delle chinine e dei loro antagonisti. La vena giugulare di coniglio ha dimostrato di contenere un sottotipo di recettore B2 (B2A) (Tabella V).
La preparazione non vascolare più comunemente usato è l’ileo di cavia, che è preso da cavie di 250-350 g e preparato come una striscia longitudinale di muscolo liscio, secondo Rang (37). Il tessuto è sospeso in vitro nella soluzione di Krebs (ossigenata a 37°C) e le sue variazioni di tensione sono misurate come descritto sopra per i vasi isolati (vedi sezione I). L’ileo di cavia è la preparazione utilizzata per caratterizzare il sottotipo di recettore B2B (Tabella V).
I recettori B1 sono studiati utilizzando la striscia dell’aorta di coniglio, preparata e trattata nello stesso modo dell’angiotensina. Il tessuto è quasi insensibile alle chinine, in particolare a desArg9BK, l’agonista del recettore Bt, all’inizio dell’esperimento. La sensibilità del tessuto aumenta nel corso di diverse ore (fino a 6-10 ore) di incubazione come recettori B1 sono formati de novo (55). Gli effetti contrattili delle chinine sono registrati e analizzati utilizzando gli stessi strumenti e approcci descritti nella sezione I per l’angiotensina. Tessuti di coniglio può essere sensibilizzato a desArg9BK da pretrattamento degli animali con lipopolisaccaridi (LPS), che viene iniettato per via endovenosa 5 ore prima di uccidere l’animale (56). Il meccanismo di generazione del recettore B1 da LPS è stato studiato (60, 61). Aorta e altri tessuti prelevati da conigli trattati con LPS rispondono a desArg9BK dall’inizio dell’incubazione in vitro (56). Allo stesso modo, le arterie renali del cane esprimono spontaneamente i recettori B1 e mostrano un’alta sensibilità alla desArg9BK (62).
Diversi composti sono stati utilizzati per caratterizzare i recettori della chinina in organi isolati, utilizzando le risposte biologiche (contrattili) di tre preparati (tabella V). Le bradichinine e la kallidina sono potenti stimolanti della vena giugulare di coniglio (RJV) e dell’ileo di cavia (GPI), mentre desArg9BK e Lys,desArg9BK sono inattivi. L’ordine opposto di potenza si osserva nell’aorta di coniglio (RA). desArg9BK è un antagonista solo sulla RA. Su queste basi, Regoli e Barabé (54) hanno proposto l’ipotesi dei due recettori della china, il B1 (RA) e il B2 (RJV, GPI, e molti altri preparati e test) che è stato caratterizzato inizialmente solo con agonisti (54) ed è stato successivamente (vedi sotto) caratterizzato con antagonisti. Gli antagonisti del recettore B2 sono stati identificati da Vavrek e Stewart (63) e successivamente migliorati da vari ricercatori (64-66) con la sostituzione di Pro3 con idrossiprolina (Hyp), con l’aggiunta di un d-Arg al terminale N, con la sostituzione di Phe8 con Leu, e con la sostituzione del dipeptide Pro7-Phe8 con d-Tic-Oic (67-69). Un prototipo di ogni serie di antagonisti è riportato nella tabella V per indicare che la b-2-tienil-elanina (Thi) non è necessaria nelle posizioni 5 e 9, mentre Hyp3 e d-Arg0 sono importanti per l’affinità, in particolare sulla RJV. La sostituzione di Phe8 con Leu, aggiunta alle altre modifiche, porta a d-ArgBK, che (a) è quasi privo di attività agonistica, e (b) è attivo sulla RJV, meno attivo sulla GPI, e piuttosto povero sulla RA (B1), e quindi è abbastanza selettivo per il sito B2. La differenza tra i valori di pA2 (di due unità log) tra la RJV e la GPI è un dato determinante per la proposta (Tabella V) di suddivisione dei recettori B2 in B2A (RJV) e B2B (GPI). D-ArgBK è un antagonista competitivo, rapidamente reversibile sia in vivo che in vitro ed è diverso da Hoe 140, che è non competitivo (nonequilibrio), probabilmente perché ha un’interazione prolungata con entrambi i siti B2A e B2B (59, 67, 68, 70). La distinzione tra B2A e B2B è supportata dai risultati ottenuti con gli ultimi due composti (Tabella V), che differiscono per il residuo in terza posizione. La presenza di Hyp favorisce l’antagonismo (pA2 7,6) sulla B2A e la parziale attività agonistica sulla B2B, mentre Tyr3 dà un potente agonista sulla B2A e un discreto antagonista (antagonista puro) sulla B2B. Questa nuova classificazione è stata presentata in un articolo di revisione (71). I siti funzionali della chinina sono quindi B, e B2 (due sottotipi sono contemplati). Diversi altri recettori (B3, B4 e B5) sono stati proposti (72-74), ma la loro esistenza non è stata dimostrata con solidi dati sperimentali (vedi revisione critica in Rif. 59). Il rilascio di istamina indotto dalla china dai mastociti peritoneali di ratto è un fenomeno aspecifico che è stato attribuito al carattere cationico delle chinine (75, 76).